Molekuláris Sejt- és Immunbiológia Doktori Iskola
Állandó link (URI) ehhez a gyűjteményhez
Általános Orvostudományi Kar
Molekuláris Sejt- és Immunbiológia Doktori Iskola
(vezető: Dr. Balogh István)
Orvostudományi doktori tanács
D183
tudományág:
- elméleti orvostudományok
Böngészés
Molekuláris Sejt- és Immunbiológia Doktori Iskola Megjelenés dátuma szerinti böngészés
Megjelenítve 1 - 20 (Összesen 121)
Találat egy oldalon
Rendezési lehetőségek
Tétel Korlátozottan hozzáférhető Modulation of human dendritic cell functionality by endotoxin tolerance and by the mammalian target of rapamycinFekete, Tünde; Rajnavölgyi, Éva; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; DE--Általános Orvostudományi Kar -- Immunológiai IntézetDCs are the most efficient antigen presenting cells that are widely distributed across various organs and tissues in the human body. Upon encounter with foreign antigens or altered self-antigens DCs become activated and initiate T cells to respond with unique functions and cytokine profile, which characteristics renders DCs potential targets for immune-based therapies. To date, DC-based immunotherapy has been broadly explored for the treatment of patients with cancer or infectious diseases; however, the overall efficacy of DC vaccines needs to be improved. To enable the development of DC-based immunotherapy we need to gain a better understanding of DC biology. The goal of the present study was to investigate DC functionality in the context of endotoxin tolerance and mTOR inhibition both of which conditions have a potentially high clinical relevance. We found that a brief pre-treatment of differentiating DCs with LPS alone or in combination with other activation stimuli resulted in persistent inactivation of moDCs. A wide range of stimulatory signals could also desensitize developing moDCs for subsequent activation by LPS and synergistic activation signals did not prevent the cells from functional exhaustion. In response to a second LPS-stimulus we detected a completely blocked induction of inflammatory cytokine genes in LPS-tolerized moDCs implying a robust impairment of the signaling cascade leading to DC activation. Studying the role of a wide variety of DC-inhibitory mechanisms we found that SOCS1, STAT3, SLAM, miR-146 and IL-10 induced by early exposure to LPS exerted only a short-term inhibitory effect on the production of IL-12. However, none of the tested molecules played an essential role in the induction of tolerance to further stimulatory signals. Next we demonstrated that the PI3K/mTOR pathway is indispensable for eliciting intact type I and III IFN responses in moDCs stimulated with polyI:C. Similarly to moDCs, the mTOR-mediated regulation is also essential to the production of type I and III IFNs in circulating CD1c+ DCs. The inhibition of mTOR functionality by rapamycin impaired the phosphorylation of IRF3 and also a few members of the MAPK family suggesting that mTOR contributes to the activation of multiple signaling pathways in the presence of viral antigens. Furthermore, rapamycin-treated moDCs showed decreased capacity to prime IFNγ secretion by naive CD8+ T-lymphocytes. Our novel results give a better insight into the regulation of DC functionality by factors controlling the activation signals induced by various microbial stimuli. Az emberi szervezet szinte minden szervében és szövetében fellelhető dendritikus sejtek (DS) hatékony antigén prezentáló sejtekként működnek. Megváltozott saját vagy testidegen struktúrákat felismerve aktiválódnak és antigén-specifikus T-sejt választ váltanak ki. E különleges képességüknek köszönhetően a DC-ek sokrétű szabályozó funkcióval rendelkeznek és immunterápiás eljárások fejlesztésére is alkalmasak. A DC-alapú vakcinák alkalmazási lehetőségeit vírus fertőzések és tumorok kezelésére széles körben vizsgálják, de a terápiás vakcinák megfelelő hatékonyságának fokozása a DC-ek összetett működésének mélyebb szintű megismerését igényli. A jelen tanulmány a DS funkciók két eltérő, a klinikai alkalmazás szempontjából kiemelten fontos vonatkozására, az endotoxin tolerancia és az mTOR általi gátló folyamatok mechanizmusának felderítésére összpontosít. Kísérleteink azt igazolták, hogy a bakteriális lipopoliszachariddal történő 2 napos előkezelés a moDC funkciók gátlásához vezet. Ezt a hatást az aktivációs jelek széles skálája képes kiváltani és az így válaszképtelenné tett DC-ek funkcióit az együttesen alkalmazott aktivációs jelek sem képesek felfüggeszteni. Mivel a LPS-dal történő ismételt stimuláció az endotoxinnal polarizált moDC-ekben nem képes kiváltani a gyulladásos citokin gének kifejeződését, a DC-ek aktivációjához vezető jelátviteli útvonalak is gátlódnak. Eredményeink szerint az LPS előkezelés- indukálta SOCS1, STAT3, SLAM, miR-146 és IL-10 molekulák rövidtávú gátló hatás révén csökkentik a monocita-eredetű DC-ek IL-12 citokin termelését, azonban egyik vizsgált molekula sem játszik meghatározó szerepet az endotoxin tolerancia hosszú távú kialakításában. További vizsgálataink a PI3K/mTOR jelátviteli pálya jelentőségét igazolták a polyI:C-vel aktivált moDC-ek I. és III. típusú interferon termelésének szabályozásában. Eredményeink szerint az mTOR funkciók rapamycinnel történő gátlása csökkenti az IRF3 és a MAPK útvonal bizonyos tagjainak foszforilációját, ami arra utal, hogy virális eredetű antigének jelenlétében az mTOR számos jelátviteli folyamat elindításához járul hozzá. Emellett a rapamycinnel kezelt moDC-ek kevésbé hatékonyak a CD8+ T-sejtek általi IFNγ termelés kiváltásában. Végezetül úgy találtuk, hogy az mTOR általi szabályozás, hasonlóan a moDC-ekhez, a perifériás vérben keringő CD1c+ DC-ek I. és III. típusú IFN termeléséhez is szükséges. Ezek a kutatási eredmények átfogó képet adnak a DS funkciók szabályozásában résztvevő molekulák szerepéről a mikrobiális stimuláció hatására aktiválódó jelátvitel pályák működése során.Tétel Szabadon hozzáférhető Histones and histone modifying proteins in a biophysical aspectHetey, Szabolcs; Székvölgyi, Lóránt; Hetey, Szabolcs; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; DE--Általános Orvostudományi Kar -- Biokémiai és Molekuláris Biológiai IntézetA H3K27M irányító (driver) mutációjának molekuláris biológiai következményei, valamint a szubsztitúció tumor iniciációra és progresszióra kifejtett hatásai tisztázatlanok. Jelen disszertációban megvizsgáltuk a H3K27M mutációt in vivo és in vitro kísérleti rendszerek alkalmazásával, és meghatároztuk biofizikai jellemzőit kromatin, nukleoszóma és nukleáris diffúzió szinten. Ezenkívül tanulmányoztuk az Ezh2 fehérjét, amelyről közismert, hogy a PRC2 fehérje komplex katalitikus alegysége és a K27M mutáció metioninjával kialakított kölcsönhatás révén megváltoztatja a tumorsejtek epigenetikai mintázatát. Végezetül megvizsgáltuk a COMPASS fehérje komplex diffúziós tulajdonságait, amelynek emlős homológja hematológiai és agyi malignus folyamatokban is érintett. Megfigyeltük, hogy a COMPASS Spp1 alegysége a meiózisban COMPASS-független működésre vált, és elősegíti a lehetséges rekombinációt iniciáló helyek kialakulását.Tétel Szabadon hozzáférhető Characterization of vessel wall-derived mesenchymal stromal cells and investigation of the effects of mesenchymal stromal cell-like cells on the differentiation of monocytesTürk-Mázló, Anett; Bácsi, Attila; Mázló, Anett; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; DE--Általános Orvostudományi Kar -- Immunológiai IntézetA mezenchimális őssejtek ígéretes terápiás lehetőséget kínálnak. Ez részben relatíve széles, multipotens differenciálódási képességének, részben pedig jelentős immunmoduláló képeségének köszönhető. Számos kórkép hátterében nem megfelelően szabályozott immunválasz húzódik meg, ami pedig a sejtek között zajló kommunikációs zavar következménye lehet. A szöveti rezidens sejtek, mint az MSC-ek meghatározó szerepet töltenek be a homeosztázis fenntartásában, képesek lehetnek azonban a kialakult patológiás állapotok támogatására is. Bár legnagyobb számban a csontvelőben fordulnak elő, az MSC-ek számos szövet, így az erek esszenciális sejtes alkotóelemei is. Az MSC-ket nem kezelhetjük egységes populációként, a különböző egyénekből származó sejtek ugyanis különbözhetnek fenotípusukban, epigenetikai hátterükben, életképességükben és a termelt oldott faktorok minőségében. A nagyfokú diverzitás megismerése érdekében célul tűztük ki egy izolálási módszer optimalizálását az érfalakban található MSC-ek (SV-MSC) kinyerésére. Megfigyeléseink alapján az izolálást követően a sejteket karakterizálnunk kell, ugyanis az MSC-ek fenotípusos tulajdonságaikban átfedést mutatnak az erek endothél rétegéban és az érfalak subendotheliális régiójában lokalizált egyéb sejttípusokkal. A részletes karakterizálás mellett az SV-MSC-eket összehasonlítottuk a széles körben használt és jól ismert csontvelői MSC-kel (BM-MSC). Az összehasonlító analízis során számos hasonló tulajdonságot találtunk, feltárásra kerültek azonban különbségek is, melyek összességében alátámasztják az eltérő állapotban lévő donorokból nyert, illetve azok különböző szöveteiből izolált MSC-ek alapos karakterizálásának fontosságát. Az MSC sejtvonalakkal történő kísérletes munka segíthet a frissen izolált MSC-ek diverzitásából fakadó nehézségek kiküszöbölésére. Munkánk során vizsgáltuk az MSCl sejtek direkt és indirekt hatását a monociták dendritikus sejtekké (DS) történő differenciációjára. A DS-ek hídként teremtenek kapcsolatot az öröklött és szerzett immunválasz között. Rendkívül plasztikus sejtekről révén szó, a monociták differenciációja számos ponton és módon befolyásolható, ezáltal biztosítva a monocitákból differenciálódó sejttípusok alkalmazkodását az adott szöveti környezethez. Az MSCl sejtek indirekt módon, ATRA (RARα ligandum) termelés révén elősegítik CTLA-4 molekulát kifejező DS-ek kialakulását, melyek képesek kiváltani az allogén, naiv T-limfociták IL-10 és IL-17 termelő sejtekké történő polarizációját. Munkánk során új mechanizmusokat sikerült feltárni, melyek szerepet játszanak az MSC-ek által kifejtett immunmoduláció során, és felhívhatják a figyelmet a sejt-mentes őssejtterápiák előnyeire.Tétel Szabadon hozzáférhető Tissue transglutaminase and TAM kinase signaling are required for proper skeletal muscle regeneration in miceNour, Al-Zaeed; Zsolt, Sarang; Nour, Al-Zaeed; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; DE--Általános Orvostudományi Kar -- Biokémiai és Molekuláris Biológiai IntézetBevezetés: A sérülést követő vázizom-regenerációhoz az izomrostok bazális laminája alatt található miogén őssejtek, úgynevezett szatellita sejtek proliferációja és differenciálódása szükséges. A beszivárgó makrofágok kritikus szerepet játszanak a folyamatban, eltávolítják a nekrotikus sejttörmeléket és miogenezist irányító citokineket bocsátanak ki. Eleinte ezek a sejtek gyulladást előidézők, de az apoptotikus sejtek fagocitózisa elősegíti fenotípusos átalakulásukat egy gyógyító makrofág fenotípus irányába, amely szabályozza a gyulladást, a mioblaszt fúziót, a növekedést, az extracelluláris mátrix lerakódását és az izomszövet re-vaszkularizációját. A Mer és az Axl TAM (Tyro3, Axl, Mer) receptor kinázok, amelyek fagocitózis receptorként működnek a makrofágokban tolerogén, illetve gyulladásos körülmények között. A szöveti transzglutamináz (TG2) egy többfunkciós enzim, amely többek között a makrofágok fagocitózisában és a gyulladás szabályozásában játszik szerepet. Célkitűzés: Célunk az volt, hogy jellemezzük a normál vázizom szerkezetet és a regenerációs folyamatot egerekben TG2 és Mer hiányában. Anyag és módszer: A kígyóméreg kardiotoxint intramuszkulárisan fecskendeztük be, hogy izomkárosodást okozzunk. Szövettani analízist végeztünk az izomrostok keresztmetszetének, az intramuszkuláris zsírszövet, a kollagén lerakódás, valamint a szöveti nekrózis mértékének felmérésére. Áramlási citometriás analízist alkalmaztunk az intramuszkuláris leukocita infiltráció és a szatellita sejtek kimutatására. Az in vitro TG2 és TAM gátlás hatását a sejtek életképességére és fúziójára C2C12 mioblaszt sejtvonal segítségével vizsgáltuk. Eredmények: A TAM kináz család egyetlen tagja, amelyet a vázizom és a C2C12 sejtek fehérje szinten kifejeztek, az Axl volt, míg a Mer volt a fő TAM kináz receptor a CD45+ sejtekben. A Mer hiánya nem volt hatással a vázizomzat súlyára vagy szerkezetére, de jelentős késleltetést okozott a nekrotikus izomsejtek eltávolításában, a gyógyító makrofágok termelődésében, és ennek eredményeként jelentősen késleltette a teljes izomregenerációt sérülést követően. Amikor a BMS-777607 TAM kináz inhibitort vad típusú egereknek adták, az a Mer hiányának az izomregenerációra gyakorolt hatását utánozta, de a nekrotikus régiók hosszú távú fennmaradását is okozta. Ezen túlmenően, a TAM kináz jelátvitel gátlása C2C12 sejtekben in vitro alacsonyabb életképességet és myotube fejlődést eredményezett, ami az Axl jelátvitel csökkenésének tulajdonítható. A TG2 hiánya nem volt hatással a vázizomzat súlyára vagy méretére, de kisebb rostokat és magasabb összrostszámot eredményezett a tibialis anterior izmokban, valamint csökkent izomerőt is az egerekben. A vad típusú izomzathoz képest a regenerálódó rostok mérete kisebb, a többmagvú rostok száma pedig kisebb volt a TG2-/- izmokban. A Mer-hiányos egerekhez hasonlóan a makrofágok átmenete a gyulladást elősegítő fenotípusból a gyógyító fenotípusba késett a TG2 null egerekben. Végül a TG2 ZDON általi gátlása a differenciálódó C2C12 mioblasztokban károsította a sejtek fúzióját és differenciálódását. Konklúzió: Eredményeink bizonyítják a TAM kináz által közvetített jelátvitel fontos szerepét a vázizomzat regenerációjában makrofágokban és mioblasztokban, és az Axl-t, mint túlélési és növekedési receptort azonosítottuk egér mioblasztokban. Azt is megállapítottuk, hogy a TG2 nélkülözhetetlen a megfelelő mioblaszt fúzióhoz in vivo és in vitro, és elvesztése az izomképződés és a regeneráció károsodásához vezet egerekben.Tétel Szabadon hozzáférhető Virális- és gazdafehérjék szerepe, kölcsönhatása az I-es típusú humán immundeficiencia vírus életciklusábanTóth, Ferenc; Tőzsér, József; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; DE--Általános Orvostudományi Kar -- Biokémiai és Molekuláris Biológiai IntézetKorábbi vizsgálatokban a HIV-1 kapszid fehérjét a virális proteáz szubsztrátjaként azonosították in vitro. Mivel a proteáz része a sejtbe bejutó magi struktúrának feltételezhetően szerepet játszik a fertőzés korai fázisában is, például a kapszid monomerek hasítása révén. Munkánk során a kapszid fehérjében azonosított hasítóhelyeken olyan mutációkat (W23A, A77P, A78V, L189F, L189I és L189P) hoztunk létre, amelyek a proteázon korábban végzett specificitás vizsgálatok eredményei alapján megváltoztatják a kapszid fehérje virális proteáz általi hasíthatóságát, ezáltal a későbbiekben eszközként szolgálhatnak a proteáz korai fázisban betöltött szerepének alaposabb vizsgálatához. A létrehozott mutáns kapszid fehérjék szerkezetében bekövetkező változásokat in silico becsültük meg, amelyet CD-spektroszkópia alkalmazásával támasztottunk alá. A fehérjék proteolízissel szembeni érzékenységét HIV-1 PR és tripszin által létrehozott hasítási termékek analízisével határoztuk meg. Eredményeink alapján elmondhatjuk, hogy az elsődleges hasítási helyekhez tartozó aminosavak mutációja általában nem csak a kapszid fehérje proteáz általi hasíthatóságát változtatja meg, hanem esetenként annak másodlagos szerkezetét és CypA kötő képességét is. Jóllehet a W23A, A77P és L189P mutációk sikeresen módosítják a proteáz általi hasítást, másodlagos szerkezetük is jelentősen megváltozik, ezáltal nem alkalmasak a célkitűzésben megfogalmazott céljainkra. Mutánsaink közül egyedül az L189F tűnik szerkezetében változatlannak a vad típushoz viszonyítva, ezáltal ez lehet a legalkalmasabb jelölt a PR általi CA hasítás korai fázisban betöltött szerepének további vizsgálatára sejtkultúrás körülmények között. A HIV-1, valamint a génterápiás célokra kifejlesztett HIV-alapú vektorok replikációja nagymértékben függ a gazdasejt saját fehérjéitől. A közelmúltban végzett kísérletek eredményeképpen több száz olyan gazdasejt fehérjét kódoló gén került kimutatásra, amelyek expressziójának változása szintén a vírusfertőzéssel hozható kapcsolatba. Ezen gének termékeinek közvetlen vizsgálata segíthet tisztázni azok pontos szerepét, így egy több géntermékre kiterjesztett proteomikai vizsgálat segíthet leszűkíteni a vizsgálandó célpontok körét. Munkánk során egy HIV-1 alapú vektorrendszer felhasználásával 293T sejtekben vizsgáltuk a pszeudovírus által okozott gazdafehérje expresszióban bekövetkező változásokat jelölés nélküli („label-free”) kvantitálás segítségével. Kísérletünk eredményeképpen sikerült azonosítanunk 25 olyan fehérjét, amelynek expressziója valamilyen irányban megváltozik a HIV-1 pszeudovírussal transzdukált sejtekben a transzdukció után 4, illetve 12 órával. Az azonosított fehérjék irodalmának vizsgálata alapján összefoglalásként elmondhatjuk, hogy a jelölés nélküli kvantitálás alkalmas módszer a sejtben bekövetkező változások nyomon követésére, ugyanis a fehérjék többségét korábban is összefüggésbe hozták a HIV-1 életciklusával. Sajnos azonban néhányuk kivételével pontos szerepük a folyamatban továbbra sem tisztázott. Véleményünk szerint a vizsgálatunk során azonosított fehérjék megfelelő célpontokat kínálhatnak a HIV-1- gazdasejt kapcsolatának vizsgálatához, amely segítséget nyújthat új, hatékonyabb antivirális terápiák kifejlesztéséhez.Tétel Szabadon hozzáférhető A P-glikoprotein konformáció változásainak és membrán mikrodomén lokalizációjának vizsgálataMészáros-Bársony, Orsolya; Goda, Katalin; Bársony, Orsolya; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskolaA P-glikoprotein klinikai szempontból az egyik legfontosabb humán transzmembrán fehérje. Fiziológiás körülmények között a szervezet számos szövetében kifejeződik, ahol aktív transzport révén kémiailag különböző vegyületek százait képes eltávolítani a sejtekből. A kemoterápia során kialakuló rezisztencia jelensége gyakran a Pgp daganatsejteken történő overexpressziójának következménye. Munkánk első részében a humán Pgp katalitikus ciklusa során bekövetkező konformáció változásokat vizsgáltuk. Kísérleteinkben a Pgp egy összetett extracelluláris epitópját felismerni képes UIC2 konformáció érzékeny monoklonális antitest egyedülálló tulajdonságait hasznosítva követtük nyomon a Pgp transzmembrán doménjeiben bekövetkező konformáció változásokat. Megállapítottuk, hogy a transzporter UIC2-reaktív, intracelluláris tér felé nyitott konformációjából az extracelluláris tér felé nyitott konformációba történő átbillenése és szubsztrátok iránti affinitásának csökkenése már az ATP hidrolízisét megelőzően bekövetkezik a katalitikus ciklus során. Munkánk második szakaszában a Pgp molekulák konformációja és membrán mikrodomén lokalizációja közötti kapcsolatot vizsgáltuk. Eredményeink alapján elmondható, hogy a permeabilizált sejtekhez hasonlóan az intakt sejteken is szoros korreláció van a sejtek ATP szintje és a sejtfelszíni Pgp molekulák UIC2-reaktivitása között. Eredményeink továbbá azt is bizonyítják, hogy a sejtek rövid távú ATP depléciója, mely a Pgp molekulákat UIC2-reaktív konformációban stabilizálja, nem befolyásolja a Pgp molekulák sejtfelszíni expresszióját és a TX-100 rezisztens membrán mikrodoménekhez való asszociációjukat sem. Azt is sikerült megállapítanunk, hogy a katalitikusan inaktív, mindkét nukleotid-kötő doménben mutációt hordozó Pgp variánsok az UIC2-reaktív konformációs állapotban stabilizálódnak, és a vad típushoz hasonló membrán mikrodomán lokalizációt mutatnak.Tétel Szabadon hozzáférhető Accessibility of DNA in chromatin: The role of constrained superhelicityBosire, Rosevalentine; Szabó, Gábor; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; DE--Általános Orvostudományi Kar -- Department of biophysics and cell biologyTranscriptional regulation plays an important role in cell differentiation and in maintaining cell phenotypes, and misregulation often leads to disease. In eukaryotes, chromatin is maintained in a repressive state by the nucleosomal structure. Consequently, transcription activation requires creation of nucleosome free regions for regulatory factor binding. Similarly, transcription elongation requires destabilization of the nucleosomes ahead of the transcribing machinery. The mechanism by which the nucleosome structure inhibits regulatory factor binding has, however, not been fully elucidated. Current knowledge from biophysical experiments challenges the possibility of limited access as the mechanism of inhibition. This is especially obvious considering that the DNA winds on the exterior surface of the core histone octamer being continuously exposed toward the surroundings. Further, it has been shown that even regions of dense chromatin packaging are freely accessible to relatively large ligands partly due to the relatively large pore-size in the chromatin matrix and to the local Brownian motion occasionally bringing sites buried in chromatin domains to the surface where large TF would bind. Therefore, the question how access to DNA in chromatin is regulated remains unanswered. I have considered the possible role of alteration of DNA structure that results from packaging of DNA into chromatin as a mechanism of controlled access. This is bearing in mind the important contribution that DNA shape makes to TF binding specificity. Further, it is well known that TF binding to DNA results in deformation of both the DNA and protein so as to form a proper fit between the macromolecules. However, such a plasticity may not be allowed in view of the limited degrees of freedom that DNA in chromatin has. In my work, I evaluated the binding of fluorescent, small molecule intercalators to DNA in situ. Intercalation requires deformation of DNA akin to that of TF binding. Given their low molecular weight, small molecules would be expected to easily access the DNA in all chromatin domains and there intercalation could be easily quantified from their fluorescence. My results revealed that intercalation was limited to extranucleosomal DNA, while intercalation into the nucleosomal DNA only became possible after histone eviction. Intercalation into extranucleosomal DNA could be moderately enhanced by topological relaxation in the wake of nicking the DNA. A single nick per 50 kbp loop was sufficient to achieve this increment revealing that the conformational change elicited readily spreads along the chromatin. Staining with DAPI, which binds to the minor groove without intercalation, was unimpeded by the presence of nucleosomes. These data have led me to conclude that the conformational constraint imposed on DNA by the several chemical bonds linking the DNA to the nucleosome core are likely responsible for this shielding of the DNA to particular small molecules from inside, while the internucleosomal DNA can adapt to bind the ligand. Next, I evaluated the effect of supercoil relaxation on the binding of HMGB1, a protein whose binding to DNA partly involves intercalation. These measurements have yielded a complex picture. Relaxation of supercoiling by using DNA nicking agents had no effect of HMGB1 binding in vivo. However, binding of Dox, a membrane permeable DNA intercalator, led to an initial increase in HMGB1 binding in vivo, followed by decreased binding at higher concentrations. In solution, intercalator binding caused a monotonous decrease in HMGB1 binding to supercoiled plasmid DNA. Having assessed also the effect of Dox on the binding of the linker histone H1, known to antagonize HMGB1 binding, has led me to conclude that Dox used at small concentrations enhances HMGB1 binding by destabilizing H1 binding, while in the higher concentration range competes with HMGB1 for the DNA. Nucleosomes emerge as major impediments of ligand binding as a result of the constraint of DNA conformation, while the extranucleosomal DNA exhibits a higher degree of conformational plasticity, allowing for a complexity of molecular interactions. Since the conformational features determining intercalation are tightly interdependent with all the other DNA conformational features, based on the powerful effect of nucleosomal constraint on intercalator binding I anticipate an analogous effect of the nucleosomal structure on any ligand binding, including that of TFs. My data also suggests that anthracycline therapy may be synergized by chemotherapeutic agents that induce DNA breaks such as topoisomerase inhibitors and bleomycin, or radiotherapy.Tétel Szabadon hozzáférhető Diet induced altered fatty acid composition and the activation of their metabolizing enzymes in miceWeiss-Hersh, Kathrin; Rühl, Ralph; Weiss, Kathrin; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskolaDietary fat provides FAs incorporated into PLs forming cellular membranes. These membranes are constantly renewed and the composition of FAs aligns according to the provided dietary fat. Influences on membrane PL FA composition were investigated in this thesis. In vivo studies in mice have been performed investigating the effect of different types of dietary fat, different amounts of sunflower oil combined with vitamin A and regulation by activated NHRs on PLs and cellular membrane FA profile. Most important findings of this thesis were that MUFA and SAFA content in PLs is strictly controlled by their metabolizing enzymes SCD1 and ELOVL6. Especially alteration of SCD1 hepatic gene expression by dietary fat altered the PLs profile of its metabolic products accordingly. The SCD1 FA ratio 18:1n9/18:0 was found to be more reliable as “desaturase index” within all conducted studies. Most surprisingly margarine diet was the strongest inducer of SCD1, it was even more effective than coconut fat diet high in SAFA. Furthermore the inductive effect of dietary vitamin A on hepatic gene expression of SCD1 and ELOVL6 was abolished if diet was combined with n6-PUFA rich sunflower oil. Sunflower oil supplemented diet suppressed SCD1 and ELOVL6 gene expression dose dependently. This assumes that nutrients might interfere with each other with unexpected outcome. ELOVL6 activity was most reliable represented by the FA ratio 18:0/16:0. On the contrary to MUFA and SAFA profile in PLs PUFAs in PLs were more but not totally dependent on available dietary PUFAs. Fish oil enriched diet suppresses the hepatic gene expression of main PUFA metabolizing enzymes FADS1, FADS2 and ELOVL5 which was reflected in reduced metabolic activity. This resulted partially in less metabolic products measured in FA profile of PLs. Repressed gene expression could be associated with reliable FA ratios representing enzymatic activity for 22:6n3/22:5n3 FADS2. PUFAs in PLs profiles are more likely to derive directly from diet, but might be adjustable by PUFA enzyme metabolism. The results of this thesis suggest further that inhibition of hepatic gene expression of fat metabolizing enzymes by n3-PUFA enriched diet is caused by reduces activity of RXR. RXR is a heterodimer forming NHR which can be activated by isoforms of vitamin A. CYP26A1 catabolizes active vitamin A derived RXR ligands into inactive metabolites. Induction of CYP26a1 by fish oil supplemented diet decreases the availability of vitamin A and less RXR is activated.Tétel Szabadon hozzáférhető Macrophage polarization signals-induced mechanisms of transcriptional and post-transcriptional repressionCzimmerer, Zsolt; Nagy, László; Czimmerer, Zsolt; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; DE--Általános Orvostudományi Kar -- Biokémiai és Molekuláris Biológiai IntézetA komplex molekuláris mikrokörnyezet szigorúan szabályozza a mkrofágok fenotípusos és funkcinális sajátosságait különböző fiziológiás és patológiás körülmények között. A makrofágok stimulációja különböző polarizációs szignálokkal, köztük citokinekkel és patogén eredetű molekulákkal, a szignálok által aktivált transzkripciós faktorokon keresztül a szignálokra specifikus génexpressziós program bekapcsolásához vezet. Szisztematikus teljes genom szintű analízis segítségével kimutattuk, az alternatív makrofág polarizációs szignálok közé tartozó IL-4 egy nagy géncsoport kifejeződését gátolja a transzkripció szintjén. Az IL-4 által aktivált STAT6 transzkripciós faktor kötődik a gátolt génekhez tartozó ehanszerekhez. Ezeken a helyeken a STAT6 kötődés együtt jár a csökkent kromatin nyitottsággal, kisebb LDTF, p300 és RNS Polimeráz II kötődéssel, valamint alacsonyabb eRNS kifejeződéssel. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az IL-4 által aktivált STAT6 transzkripciós faktor képes represszorként működni a makrofágokban. Továbbá megfigyeltük, hogy az IL-4/STAT6 szignálútvonal által kiváltott represszió képes csökkenteni a makrofágok gyulladásos válaszkészségét, köztük az NLRP3 inflammaszóma aktivációt, az IL-1βtermelődést és a piroptózist. Összességében ezek az eredmények felvetik egy kétirányú kölcsönhatás lehetőségét az alternatív makrofág polarizáció és a gyulladásos szignálok között, amely jelentősen befolyásolhatja a makrofágok különböző mikrobiális, stressz és sérülés eredetű szignálokkal szembeni érzékenységét és válaszkészségét. A miRNS-ek által kiváltott poszt-transzkripciós gátlás szintén hozzájárul a makrofágok funkciójának szabályozásához. A munkánk során azonosítottuk, a miR-342-3p-nek és EVL gazdagénjének IL-4/STAT6 szignálútvonal által kiváltott közvetlen indukcióját. Érdekes módon a miR-342-3p csökkenti a makrofág életképességet közvetlenül szabályozva egy a Bcl2l1 gént is magában foglaló antiapoptotikus génhálózatot. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy IL-4/STAT6 szignálútvonal által indukált miR-342-3p részt vesz az IL-4 által kiváltott sejtosztódás szabályozásában a folyamat negatív regulátoraként. Végül feltérképeztük a gyulladásos miRNS-ek, köztük a miR-155, miR-147 és miR-223 transzkripciós szabályozását egy integrált új-generációs szekvenálás alapú megközelítés alkalmazásával. Kimutattuk, hogy a miR-155 kifejeződésének LPS által kiváltott aktiválása a pri-miR-155 transzkripciós starthelye és távoli enhenszerei közötti intenzív kommunikáción alapszik, amely együtt jár a miR-155-öt kódoló genomi régió gyulladásos szignál által kiváltott átrendeződésével. The complex molecular microenvironment tightly determines the phenotypic and functional features of macrophages in different physiological and pathological conditions. The macrophage exposure to different polarization signals including cytokines and pathogen-derived molecules leads to the activation of signal specific gene expression program via SRTFs. Our systematic genome-wide analysis revealed that the alternative macrophage polarization signal IL-4 represses large gene set at the transcriptional level. IL-4-activated STAT6 binds the repressed genes-linked distal regulatory elements. The STAT6-binding was associated with reduced chromatin openess, LDTF, p300 and RNAPII binding as well as decreased eRNA expression. These results suggest the IL-4-activated STAT6 transcriptional factor can act as a transcriptional repressor in macrophages. In addition, we found that the IL-4/STAT6 signaling pathway-mediated transcriptional repression diminishes the inflammatory responsiveness of macrophages including NLRP3 inflammasome activation, IL-1β production and pyroptosis. Taken together, these results suggest that complex bidirectional interactions exist between alternative macrophage polarization and inflammatory signals that influence the responsiveness and sensitivity of macrophages toward microbial-, stress-, and damage-associated endogenous signals. The miRNA-mediated post-transcriptional repression also contributes in the regulation of macrophage function. Here, we identified that miR-342-3p and their host gene EVL are directly induced in human and mice by IL-4/STAT6 signaling pathway. Interestingly, miR-342-3p can reduce macrophage survival via direct targeting of anti-apoptotic gene pathway including Bcl2l1. These results suggest that IL-4/STAT6 signaling pathway-induced miR-342-3p potentially participate in the negative feed-back regulation of IL-4-mediated macrophage proliferation. Finally, we characterized the transcriptional regulation of the inflammation responsive miRNome including miR-155, miR-147 and miR-223 using an integrated NGS-based approach. Here we show that LPS-dependent transcriptional induction of miR-155 expression is based on an intensive communication between the distal anhancers and the pri-miR-155-linked TSS and associated with the reorganization of the pri-miR-155-coding genomic locus.Tétel Szabadon hozzáférhető A xenotróp egér leukémia vírussal rokon vírus (XMRV) proteáz biokémiai karakterizálásaMatúz, Krisztina; Tőzsér, József; Matúz, Krisztina; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskolaCélul tűztük ki a xenotrópikus egér leukémia vírussal rokon vírus (XMRV) proteáz kinetikai vizsgálatát, az enzim stabilitásának és gátolhatóságának vizsgálatát HPLC valamint SDS-PAGE módszerek segítségével. Az enzim kinetikai paramétereit (KM, kcat, kcat/KM) szintetikus oligopeptid szubsztrát segítségével vizsgáltuk, az enzim dimerizációs képességét (Kdapp), valamint az enzim denaturációra hajlamát (UD50) 0-4 M urea tartalmú közegben. Vizsgáltuk a proteáz gátolhatóságát különböző proteáz inhibitorok (amprenavir, TL-3, acetil-pepsztatin és pepsztatin A) segítségével, magas ionerősségű közeg esetében HPLC módszert, míg alacsony sókoncentráció esetén SDS-PAGE módszert alkalmaztunk a gátlás nyomon követésére. Az SDS-PAGE módszer esetén szubsztrátként egy rekombináns egér leukémi vírus (MLV) Gag fragmentumot alkalmaztunk. Összehasonlítottuk az enzim stabilitási értékeit a 1-es típusú humán immundeficiencia vírus (HIV-1) proteáz értékeivel. Molekuláris modellezéssel hasonlítottuk össze a HIV-1 és XMRV proteázoknak az acetil-pepsztatin és pepsztain A inhibitorokkal alkotott komplexeit, a számított kölcsönhatási energiák segítségével vizsgáltuk az inhibitorok lehetséges kötőmódjait. Kollaborációs partnereink az enzim-inhibitor komplexeket (amprenavir, TL-3, acetil-pepsztatin és pepsztatin A) röntgenkrisztallográfiás elemzésnek vetették alá, ezzel magyarázatot adva a gátlás lehetséges módjára. Az XMRV proteáz jóval érzékenyebbnek bizonyult az urea koncentrációra, mint a HIV-1 proteáz. A Ki értékek alapján a tesztelt inhibitorok közül az amprenavir bizonyult a leghatékonyabb, míg a pepsztatin A a legkevésbé hatékony inhibitornak. A korábbi és jelenlegi molekuláris modellezésen alapuló vizsgálatok alapján megállapítottuk, hogy az S4/S4’ kölcsönhatás is lényegesen hozzájárul az acetil-pepsztatin és pepsztatin inhibitoroknak a HIV-1 és az XMRV proteázokhoz történő kötődéséhez. Az XMRV proteáz-pepsztatin A két inhibitoros kötőmódja energetikailag kedvezőbb, míg az acetil-pepsztatin esetében az egyszeres és kettős kötődési mód hasonló kölcsönhatási energiákat adott. Az S3/S3’ kötőhely mérete XMRV esetén kisebb, mint a HIV-1 esetén, így a Sta6-S3’ kölcsönhatás sokkal kedvezőbb a HIV-1 PR esetében, mint az XMRV PR-nál, ezért a HIV-1 az egyszeres kötési módot részesíti előnyben. A röntgenkrissztallográfiai adatok alapján, megállapítottuk, hogy az acetil-pepsztatin a többi inhibitorhoz képest eltérő módon kötődik az enzimhez, mivel két inhibitor molekula kötődik az XMRV PR dimerjéhez, míg a TL-3 és az amprenavir egyetlen molekulával kötődik, mégis az inhibitorok és az enzim közötti kölcsönhatások rendkívül hasonlóak. Our objective was the kinetic examination of the viral protease related to the xenotropic murine leukemia virus (XMRV) and the examination of the stability and inhibition of the enzyme with the help of the HPLC as well as the SDS-PAGE methods. We examined the kinetic parameters of the enzyme (Km, kcat, kcat/Km) with the help of a synthetic oligopeptide substrate while the stability of the enzyme, i.e. its ability to dimerize (Kdapp) and the tendency of the enzyme towards dissociation (UD50) - in a buffer containing an incrementing urea concentration by applying a chromogenic substrate. We examined the inhibition of the protease with the help of various protease inhibitors (amprenavir, TL-3, acetyl-pepstatin and pepstatin A), while applying the HPLC method in a high salt concentration buffer, and the SDS-PAGE method in the case of a low salt concentration to follow up the inhibition measurements. In the case of the SDS-PAGE method we applied an MLV Gag fragment as a substrate. We compared the stability values of the enzyme with the values of the HIV-1 protease. We modeled the enzyme-inhibitor complex formed in this way (in the case of acetyl-pepstatin and pepstatin A) and we examined the interaction energies and the potential binding of the inhibitors. The XMRV protease proved to be much more sensitive to the concentration of urea than the HIV-1 protease. Among the inhibitors tested on the basis of Ki values amprenavir proved to be the most efficient inhibitor while pepstatin A – the least efficient inhibitor. On the basis of molecular modeling we established that the S4/S4’ interaction also substantially contributes to the binding of the acetyl-pepstatin and pepstatin inhibitors to the HIV-1 and XMRV proteases. The two-inhibitor binding method of the XMRV protease-pepstatin A is more favorable from an energetic point of view, while in the case of acetyl-pepstatin, the interaction of the dual binding method provided similar interaction energies. The Sta6-S3’ interaction is much more favorable in the case of the HIV-1 PR than in the case of the XMRV PR, thus HIV-1 prefers the single binding method. X-ray crystallographic data were disclosed to us by our collaboration partner, on the basis of which we established that pepstatin A binds to the enzyme in a different manner as compared to other inhibitors, as two inhibitor molecules are bound to the PR dimer of XMRV while TL-3 or amprenavir with a single molecule, yet the interactions between the inhibitors and the enzyme are remarkably similar.Tétel Szabadon hozzáférhető Citoszólikus szenzorok aktivitásának és szabályozó mechanizmusaiknak vizsgálata plazmacitoid dendritikus sejtekbenBencze, Dóra; Pázmándi, Kitti Linda; Bencze , Dóra; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; Debreceni Egyetem::Általános Orvostudományi KarA NOD-szerű receptorok (NLR) az immunrendszer erősen konzervált citoszólikus mintázat felismerő receptorai (PRR), melyek multifunkcionális tulajdonságuk révén nemcsak a kórokozók és a szöveti sérülések veszély jeleinek felismerésében vesznek részt, hanem a sejt szinte minden funkciójára hatással vannak, kezdve az autofágiától a transzkripció aktivációjáig. Rendkívül fontos tulajdonságuk továbbá, hogy képesek más PRR-ek jelátviteli útvonalait szabályozni, illetve multiprotein inflammaszóma komplexeket képezhetnek, ezzel pedig meghatározhatják mind az antibakteriális, mind az antivirális immunválasz kimenetelét. A plazmacitoid dendritikus sejtek (pDS) szervezetünk professzionális I-es típusú interferon (IFN) termelő sejtjei, melyek nagymértékű IFN termelő képességük révén egyedülálló antivirális aktivitással bírnak, ugyanakkor az autoimmun folyamatok patogenezisében is szerepet játszanak, így fontos terápiás célpontok. Azonban a pDS-ekben a citoszólikus PRR-ek szerepe és szabályozó mechanizmusaik kevésbé feltártak. Így kutatásunk célja az volt, hogy a humán pDS-ekben is megvizsgáljuk a különböző NLR-ek szabályozó receptor interakcióit, illetve az inflammaszóma formáló képességüket. Kimutattuk, hogy az NLRX1 és az NLRC5 negatívan szabályozza a RIG-I-szerű receptorok (RLR) közvetített I-es típusú IFN termelést a pDS-ekben és a monocita eredetű dendritikus sejtekben (moDS) is, míg a pro-inflammatórikus citokin választ csak az NLRX1 gátolja és csak a moDS-ekben. Ezen eredményeink azt mutatják, hogy a sejtspecifikus hatás mellett, a regulatórikus NLR-ek főként azon sejtfunkciók esetében szolgálhatnak negatív visszacsatolási mechanizmusként, melyek jelentős mértékben meghatározzák az adott sejt profilját. Bizonyítottuk továbbá, hogy a regulatórikus NLR-ek mellett az NLRP3 inflammaszóma is funkcionál a pDS-ekben. Eredményeink alapján erős NF-κB induktorokra és specifikus másodlagos, az inflammaszómát aktiváló jelekre is szükség van pDS-ekben a biológiailag aktív, érett IL-1β szekréció kiváltásához. Azonban az NLRP3-függő IL-1β szekréciós útvonal csak olyan gyulladásos körülmények között lehet aktív a pDS-ekben, melyekben az I-es típusú IFN útvonal aktivitás nem dominál, mivel a magas I-es típusú IFN szinttel járó állapotok számos NLRP3 gátló fehérjének az expresszióját fokozzák. Munkánk során tehát sikerült új receptor interakciókat, illetve inflammaszóma aktivitást feltárnunk egy olyan sejttípusban, melynek szerepe számos patológiás állapotban ismert. A pDS-ek és az NLR-ek nem megfelelő működése is lényeges kóroki tényezőnek minősül a fertőzések kimenetelét, illetve az autoimmun folyamatok kialakulását illetően, ezért a pDS-ek citoszólikus receptorainak és szabályozó mechanizmusaiknak átfogóbb megismerése új célpontokkal szolgálhat számos kórkép terápiás eljárásainak hatékonyabbá tételéhez.Tétel Szabadon hozzáférhető A RIPK1-függő sejthalál szerepe az immunválasz szabályozásábanVarga, Zsófia; Koncz, Gábor; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; DE--Általános Orvostudományi Kar -- Immunológiai IntézetNapjainkra nyilvánvalóvá vált, hogy az immunrendszer aktivációja és bizonyos sejthalál folyamatok összekapcsolódnak. A veleszületett immunrendszer legfőbb sejtes alkotói a makrofágok és a DS-ek, amelyek a kórokozók jelenlétére válaszul pro-inflammatórikus reakciót generálnak. Az immunsejtek túlzott aktivációja azonban szövetkárosodást okozhat, és olyan kórképekhez vezethet, mint az autoimmun vagy tumoros megbetegedések. Tanulmányoztuk a gyulladást kiváltó nekroptózist és az apoptózis RIPK1-függő formáját. Megfigyeltük, hogy a makrofág sejttípusok eltérő érzékenységet mutatnak a TAK1 inhibitor kezelésre, amely intenzívebb nekroptózist indukált az M2 és TAM-szerű sejtekben. Eredményeink alapján az eltérő nekroptózis-érzékenység nem az M2 által termelt autokrin citotoxikus, vagy az M1 által termelt túlélő faktor hatása. Magyarázat lehet erre, hogy eddig ismeretlen jelátviteli mechanizmusok túlélő jelet biztosíthatnak az M1 makrofágokban. Eredményeink szerint legalább két nekroptotikus útvonal működik a makrofágokban. Továbbá a makrofág funkciók szabályozására alkalmas körülményeket azonosítottuk, amikor a TAK1-gátló használatával az M1 és M2 sejthalálra való hajlamuk eltérő. A RIPK1-függő sejthalál folyamatok molekuláris mechanizmusát moDS-ekben tanulmányoztuk. A DS-ek citotoxikus képességgel is rendelkeznek, ezáltal képesek a környező sejtek apoptózisát indukálni. Ez lehetőséget biztosít a környező sejtek antigénjeinek felszabadítására és a mikrokörnyezetük monitorozására. Feltételeztünk, hogy a sejtkárosító hatást a patogének érzékelése váltja ki. Eredményeink szerint a DS-ek rövid ideig tartó, PRR agonistákkal kondicionált felülúszója különböző sejtvonalakban képes sejthalált indukálni. A humán moDS-ek szerte a szervezetben előfordulnak, hozzájárulnak az immunrendszer és a szöveti mikrokörnyezet közötti információk átadásához, ezáltal az immunválaszok finomhangolását látják el mind normál, mind pedig patológiás körülmények között. Megfigyeltük, hogy az általunk vizsgált, tolerogén mikrokörnyezet csökkentheti a DS sejtpusztító képességét, míg az IFN-α jelenlétében differenciált immunogén DS-ek felülúszója nem befolyásolta a sejthalál mértékét. Munkánk során kimutattuk, hogy a rövid ideig tartó PRR stimulus hatására a DS-ek felülúszója RIPK1-függő módon a célsejtek apoptózisát váltja ki. Összegzésként elmondható, hogy olyan mechanizmusokat tárnunk fel a makrofág és a DS funkciók szabályozásában, amelyek reményeink szerint felhasználhatóak lesznek különböző gyulladásos folyamatok vagy tumoros megbetegedések immunterápiás célpontjaiként is. Nowadays, it has become apparent that the activation of immune system and certain cell death processes are connected. The major cellular components of the innate immune system are macrophages and dendritic cells (DCs). These cells are able to generate a pro-inflammatory reaction in response to the presence of pathogens. However, excessive activation of immune cells can result in tissue damage and lead to conditions such as autoimmune or tumor diseases. In our work, we studied the inflammatory-inducing necroptosis and the RIPK1-dependent form of apoptosis. Our experiments helped us to have a more detailed view on the molecular mechanism of these RIPK1-dependent cell death processes and their effect on the immune response. Targeted elimination of M1 and M2 may provide outstanding therapeutic benefits in cardiovascular and chronic inflammatory diseases, infections, or tumors. Based on literature data, macrophages are known to resist to most apoptotic stimuli but sensitive to newly discovered inflammatory forms of regulated cell death. In our work, we compared the sensitivity of human monocyte-derived M1 and M2 cells to different cell death signals. In the present study, we observed that macrophage cell types show different sensitivity to TAK1 inhibitor treatment, which induced more intense necroptosis in M2 and TAM-like cells. Based on our results, it can be concluded that the different necroptosis susceptibility is not the effect of the autocrine cytotoxic produced by M2 or the survival factor produced by M1. A possible explanation for this phenomenon might be that hitherto unknown signaling mechanisms may provide a surviving signal in M1 cells. Our results show that there are at least two different necroptotic pathways in macrophages. Furthermore, conditions suitable for the regulation of macrophage functions have been identified when M1 and M2 have different tendencies to cell death using the TAK1 inhibitor. We studied the molecular mechanism of RIPK1-dependent cell death processes in moDCs. Preliminary studies have shown that DCs also have cytotoxic function, thus being able to induce apoptosis of surrounding cells. This function provides the professional antigen presenters with the ability to release antigens from surrounding cells and to monitor their microenvironment. In our work, we hypothesized that the cell-damaging effect is induced by the detection of pathogens. The results of our experiments show that short-term, PRR agonist-conditioned supernatants of DCs can induce cell death in different cell lines. Human moDCs occur throughout the body, significantly contributing to the communication between the immune system and the tissue microenvironment, thereby fine-tuning immune responses under both normal and pathological conditions. We observed that the dexamethasone-induced tolerogenic microenvironment may reduce the cell killing ability of DC, whereas the supernatant of immunogenic DCs differentiated in the presence of IFN-α did not affect the rate of cell death. In our work, we showed that the supernatant of short-term PRR stimulated DCs induces apoptosis of the target cells in a RIPK1-dependent manner. In summary, we have successfully described new mechanisms in the regulation of macrophage and DC functions those we hope to be useful as immunotherapeutic targets for various inflammatory processes or tumor diseases in the future.Tétel Szabadon hozzáférhető Studying the transport mechanism of human P-glycoprotein (ABCB1) and Breast Cancer Resistance Protein (ABCG2)Tarapcsák, Szabolcs; Goda, Katalin; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; DE--Általános Orvostudományi Kar -- Biofizikai és Sejtbiológiai Doktori IskolaA daganatos megbetegedések világszerte a vezető halálokok közé tartoznak. Számos terápiás lehetőség áll rendelkezésre a daganatok kezelésére, így például sugárterápia, immunterápia vagy kemoterápia. A kemoterápiás kezelések során gyakran figyelhető meg, hogy a tumor rezisztenciát alakít ki a kezelés során alkalmazott gyógyszerrel szemben. A tumorok drog rezisztenciájáért gyakran az ATP-kötő kazettás (ATP- binding casette, ABC) fehérjék családjába tartozó membrán transzporterek, így pl. a P- glikoprotein (Pgp, ABCB1, MDR1) vagy a Mellrák Rezisztencia Fehérje (ABCG2, BCRP) fokozott expressziója tehető felelőssé. A Pgp és ABCG2 rendkívül széles és részben átfedő szubsztrát specificitással rendelkezik. A Pgp és ABCG2 egyaránt képes számos kémiailag eltérő, 300-2000 Da molekula tömegű, hidrofób vagy amfifil tulajdonságú ágens transzportjára, azonban keves fiziológiás szubsztrát ismert. A retinoidok potenciális Pgp és/vagy ABCG2 szubsztrátok/modulátorok fizikokémiai tulajdonságaik alapján. A retinoidok fiziológiás és klinikai jelentősége miatt célul tűztük ki a retinoidok és a Pgp/ABCG2 közötti kölcsönhatások vizsgálatát. A humán ABC transzporterek, így pl. a Pgp és az ABCG2 transzport ciklusának pontos molekuláris részletei a mai napig nem teljesen tisztázottak. Munkánk következő felében, egy intakt NBD-vel rendelkező mutáns Pgp molekulák segítségével vizsgáltuk a nukleotid-kötő helyek közötti funkcionális kapcsolatot a Pgp katalitikus ciklusa során.Tétel Szabadon hozzáférhető Humán transzglutaminázok extracelluláris folyadékokban: a XIII-as véralvadási faktor izopeptidáz aktivitásának és a transzglutamináz 4 biokémiai karakterizálásaCsobán-Szabó, Zsuzsa; Király, Róbert; Szabó, Zsuzsa; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; DE--Általános Orvostudományi Kar -- Biokémiai és Molekuláris Biológiai IntézetA transzglutaminázok kutatásának jelentőségét számos ipari és transzlációs medicinában való alkalmazhatóságuk igazolja. Az egyik legismertebb transzglutamináz a hFXIII-A transzamidáz aktivitásának gátlása új terápiás lehetőséget kínál a trombózis gyógyításában. Azonban a hFXIII-A kevésbé ismert izopeptidáz aktivitásával is képes az alvadék destabilizálására. Olyan fehérje-peptid alapú anizotrópiás aktivitásmérési módszert fejlesztettünk, amely lehetővé teszi a hFXIII-A által katalizált ellentétes irányú reakciók vizsgálatát ugyanazon szubsztrát molekulákat alkalmazva, transzamidáz aktivitásmérés esetén két szubsztrát molekulaként (FLpepPI2 és S100A4(GST)), izopeptidáz aktivitás követésénél pedig előre keresztkötött szubsztrát formájában (FLpepPI2-S100A4(GST). A fehérje-peptid szubsztrátok alkalmazása jobban modellezi a hFXIII-A in vivo szubsztrátjait az alvadék módosításai során és lehetséges mutáns hFXIII-A enzimek ellentétes aktivitásainak, illetve a hFXIII-A aktivitásait szabályozó regulátor molekulák hatásának komplex tanulmányozása. Egy másik szekretálódó családtag, a humán TG4 (hTG4) szerepet játszik a prosztatadaganatok kialakulásában és az APS1 autoimmun betegség esetén hozzájárul a férfiak meddőségének kialakulásához. A TG4 rágcsálókban jól karakterizált, azonban a hTG4 biokémiai tulajdonságai, amelyek segíthetnének az enzim funkciójának megértésében nem ismertek. Proteomikai adatbázisokat vizsgálva azt találtuk, hogy a hTG4 a prosztatán kívül is jelen van. A mikrotiter lemez módszer segítségével a hTG4 transzamidáz aktivitását és szabályozását in vitro tanulmányoztuk. A hTG4 alacsony transzamidáz aktivitással rendelkezik, amely enyhén alacsony pH-t és redukáló környezetet preferál. Szubmicelláris SDS koncentráció aktiváló hatása figyelhető meg, amely azt sugallja, hogy az enzim membránhoz kötődve fejti ki aktivitását. A patkány TG4-gyel szemben, a hTG4 nem köti a GTP-t. Más transzglutaminázok esetén ismert proteolitikus aktiválás nem figyelhető meg a hTG4 esetében, amelyet diszpázzal inkubálva illetve AD-293 sejtekben expresszált hTG4 esetén vizsgáltunk. Nyálban 280 potenciális hTG4 interakciós partnert azonosítottunk, amelyek nagy része a szekrécióhoz, immunfolyamatokhoz és vezikuláris transzporthoz köthető. Nyálban és AD-293 sejtextraktumban számos hTG4 glutamin donor szubsztrátot azonosítottunk. Néhány szubsztrát sejt-sejt interakciókban, adhézióban és proliferációban vesz részt, amely azt sugallja, hogy a hTG4 daganatellenes terápia célpontjává válhat. Eredményeink hozzájárulnak a hTG4 és a hFXIII-A sajátságainak teljesebb megismeréséhez és megerősítik, hogy ezek a fehérjék valós célpontok lehetnek gyakori betegségek terápiájában.Tétel Szabadon hozzáférhető Comparative analysis of NLRP3 inflammasome-mediated IL-1β production in different types of human monocyte-derived macrophagesBudai, Marietta Margit; Benkő, Szilvia; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; DE--Általános Orvostudományi Kar -- Élettani IntézetAz IL-1β egy „karmester” citokin, mely számos fiziológiai és immunológiai folyamatot szabályoz. Központi szerepének köszönhetően aktív formájának szekréciója szigorúan szabályozott az ún. inflammaszóma multiprotein komplex által. Az NLRP3 inflammaszóma az egyik leginkább tanulmányozott inflammaszómák közé tartozik, mely az NLRP3 szenzorból, az ASC adaptorból és a kaszpáz-1 enzimből áll.Az NLRP3 inflammaszóma funkcióinak tanulmányozására modelként leggyakrabban humán makrofágokat alkalmaznak. A makrofágok képlékeny sejtek, melyek különböző morfológiai és funkcionális tulajdonságok alapján csoportosíthatóak. A humán monocitából történő differenciálódásuk nagymértékben függ a mikrokörnyezet stimulusaitól és a makrofág kolóniastimuláló faktor (M-CSF) vagy a granulocita-makrofág kolóniastimuláló faktor (GM-CSF) jelenlététől. A makrofágok az immunválasz kialakulásának erős indukáló és szabályozó sejtjei. Ezek az immunsejtek nemcsak a fertőzés vagy sérülés által kiváltott gyulladás kialakulásában, hanem a gyulladási folyamatok leállításában, a sebgyógyulásban és a szöveti regenerációban is központi szerepet játszanak.Célunk egy összehasonlító tanulmány elkészítése volt, mely az NLRP3 inflammaszóma aktiválódás dinamikai és molekuláris mechanizmusait vizsgálja humán monocita eredetű, M-CSF jelenlétében (M-MF) vagy GM-CSF jelenlétében (GM-MF) differenciálódott makrofágokban LPS kezelést követően. Továbbá munkánk során megvizsgáltuk a természetes eredetű, immunmoduláló Aloe Vera hatását is a makrofágokra, amit a hagyományos orvoslásban elsősorban a fertőzések, a gyulladás és a sebgyógyulásban alkalmaznak.Tétel Szabadon hozzáférhető Rekombináns fehérje szubsztrátok alkalmazása HIV-1 és SARS-CoV-2 proteázok vizsgálatára és egy bioréteg interferometria-alapú mérési módszer kidolgozásáraMiczi Márió; Mótyán János András; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; DE--Természettudományi és Technológiai Kar -- Biokémiai és Molekuláris Biológiai IntézetA proteázoknak jelentős szerepe van különböző fertőző megbetegedések kialakulásában, példaként említhető a különböző vírusok replikációs ciklusához nélkülözhetetlen proteázoknak a vírus érést elősegítő funkciója, ezért fontos ezen enzimek szerkezeti felépítésének és működésének részletes megismerése. A kutatócsoportunk által kidolgozott, proteolitikus enzimek vizsgálatára alkalmas rekombináns fluoreszcens fehérje szubsztrát rendszer alkalmazását alapul véve célul tűztük ki a HIV-1 proteáz (PR) szubsztrát-specificitásának vizsgálatát a HIV-1 nukleokapszid proximális cink-ujj motívumában lévő hasítóhelyet reprezentáló szubsztrátokkal, valamint a szubsztrátok konformációs állapotainak vizsgálatát. Mindezek mellet célunk volt a SARS-CoV-2 fő proteáz (Mpro) ismert és in silico módszerekkel jósolt hasítási szekvenciáit tartalmazó szubsztrátok vizsgálata, az enzim gazdasejt szubsztrátjainak azonosítása céljából. Továbbá, célkitűzéseink közé tartozott a rekombináns fehérje szubsztrátok használatán alapuló, újszerű méréstechnikai módszer kidolgozása, a proteolitikus hasítás valós idejű detektálására alkalmas mérési módszer kidolgozása révén. A HIV-1 PR vizsgálata során elvégeztük a különböző nukleokapszid hasítóhelyet reprezentáló szubsztrátok hasítási hatékonyságainak összehasonlító vizsgálatát, mely során a legnagyobb mértékű szubsztrát-konverziót az N17F mutáns esetében tapasztaltuk, eredményeink összhangban vannak a korábban oligopeptid szubsztrátokon meghatározott aminosav preferenciákkal. A szubsztrátok konformációs állapotainak vizsgálata során megállapítottuk, hogy a HIV-1 PR nem hasította a cink-ujj motívumot cink ion jelentétében, míg a szupermásodlagos szerkezet kialakulását megakadályozó EDTA és DDT jelenlétében processzálást tapasztaltuk. A SARS-CoV-2 Mpro vizsgálata során igazoltuk, hogy az enzim az ismert és a jósolt hasítóhely szekvenciákon belül egyaránt képes hasítani a vizsgált szubsztrátokat. Sikeresen azonosítottuk a hasítási pozíciókat a szekvenciákon belül, majd enzimkinetikai méréseket végeztünk a szubsztrát-specificitás vizsgálata érdekében. Munkánk eredményeként azonosítottuk a SARS-CoV-2 Mpro egy korábban ismeretlen szubsztrátját, a humán CTBP1 fehérjét, valamint a fehérjében lévő új hasítóhelyet, melyet az enzim kisebb hatékonysággal hasított a SARS-CoV-2 poliprotein egy autoproteolitikus hasítóhely szekvenciájához képest. A rekombináns fluoreszcens fehérje szubsztrátokat felhasználtuk egy új, a proteolitikus aktivitás mérésére alkalmas, bioréteg interferometria-alapú módszer kidolgozására. A mérés körülményeinek optimalizálását követően a módszert sikeresen alkalmaztuk a HIV-1 PR specificitásának tanulmányozása során, valamint igazoltuk az enzimfelszíni szubsztrátkötő árok szerepét a szubsztráttal való kölcsönhatások kialakításában. Módszerünk segítheti a BLI ezen új felhasználási lehetőségének elterjedését, mert lehetővé teszi a proteáz aktivitás valós idejű mérését kis térfogatban és nagy áteresztőképességű rendszerekkel is kompatibilis.Tétel Szabadon hozzáférhető A P-glikoprotein szubsztrátkötő képességének vizsgálata a katalitikus ciklus során, és gátlása UIC2 monoklonális antitest segítségévelSzalóki, Gábor; Goda, Katalin; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; DE--Általános Orvostudományi Kar -- Biofizikai és Sejtbiológiai IntézetA P-glikoprotein (Pgp) egy ABC transzporter, mely a tumor sejtek plazmamembránjában kifejeződve képes a daganatos betegségek kemoterápiája során alkalmazott gyógyszerek többségét eltávolítani a tumor sejtekből, így részt vesz a multidrog rezisztencia kialakulásában. A Pgp általi transzport folyamat molekuláris hátterének jobb megismerése elősegítheti hatékonyabb gyógyszerek kifejlesztését és a multidrog rezisztencia legyőzését. A Pgp konformáció változásait és szubsztrát kötését nyomon követve a katalitikus ciklusának különböző lépései során, bizonyítottuk, hogy már az ATP kötődése kiváltja a transzporter átfordulását az intracelluláris oldal felé nyitott konformációból az extracelluláris oldal felé nyitott konformációba, melynek során a szubsztrát kötőhely szubsztrátok iránti affinitása is lecsökken lehetővé téve a szubsztrát eltávolítását. Bizonyítottuk, hogy a mindkét nukleotidkötő domén (NBD) Walker A szekvenciájában mutációt hordozó Pgp variáns inaktív, míg csak az egyik NBD-ben mutáns Pgp variánsok megőrizték ATP hidrolízis és szubsztrát transzport képességüket. Utóbbi eredményeink összhangban vannak azzal az elképzeléssel, hogy a Pgp két katalitikus helye közül ciklusonként véletlenszerűen köteleződik el az egyik az ATP hidrolízisre. Az UIC2 konformáció érzékeny kötődésű anti-Pgp ellenanyag képes a Pgp általi szubsztrát transzportot részlegesen gátolni. Azonban bizonyos Pgp szubsztrátok és modulátorok (pl. ciklosporin A (CsA)) jelenlétében az antitest gátló hatása teljessé tehető. A Pgp gátláshoz szükséges CsA koncentráció tizedének és az UIC2-nek az együttes alkalmazása a Pgp-t expresszáló KB-V1 sejtek esetében csaknem a Pgp negatív sejtek szintjére csökkentette a sejtek doxorubicin (DOX) rezisztenciáját, míg az UIC2-nek önmagában alkalmazva nem volt lényeges hatása. Xenotranszplantált SCID egerekben DOX-UIC2-CsA kombinált kezelés hatására a beültetett drog rezisztens tumorok tömege körülbelül 10%-a volt a kontroll állatokban kifejlődött tumoroknak, és az állatok felében nem is fejlődött ki tapintható daganat. Ezzel szemben a csak DOX-szal kezelt álltokban a kezelésnek nem volt szignifikáns hatása. In vitro kísérleteinkkel ellentétben azonban a SCID egerek esetében akkor is tapasztaltunk tumor növekedés gátlást, ha az állatokat csak UIC2 és DOX kombinációjával kezeltük. Eredményeink alátámasztják, hogy az UIC2 kezelés in vivo hatékonyságához immunológiai tényezők is hozzájárulhattak, és a DOX-UIC2-CsA kombinált kezelés erőteljes tumor-ellenes hatásának a hátterében a Pgp gátlása mellett ellenanyagfüggő sejtközvetített citotoxicitás (ADCC) is áll.Tétel Szabadon hozzáférhető COUP-TFII árva magreceptor általi kötőesemények genomszintű vizsgálata daganatos sejtekbenErdős, Edina; Bálint, Bálint László; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; DE--Általános Orvostudományi Kar -- Biokémiai és Molekuláris Biológiai IntézetA magreceptorok, mint ligand-aktivált transzkripciós faktorok közvetlen hatást gyakorolnak a gének kifejeződésére. A gének kifejeződésében létrejövő változások a daganatos betegségek egyik jellemvonása. Genomszintű vizsgálatokkal lehetővé válik a magreceptorok általi transzkripciós program tanulmányozása, mely által közelebb kerülhetünk a betegség megértéséhez. A magreceptorok általi szabályozások vizsgálatához használt legelterjedtebb módszer, a kromatin immunprecipitáció (ChIP). Kutatásunk során létrehoztunk egy olyan fágbemutatáson alapuló kontroll rendszert az ösztrogén receptor alfa (ERα) antitest példáján keresztül, mellyel ChIP antitestek karakterizációja válik lehetővé ChIP-qPCR kísérletekben. Az ERα kulcsfontosságú magreceptor az emlőrák kezelésében és kimenetelében. Munkánk során a COUP-TFII árva magreceptor szerepét vizsgáltuk meg ER-pozitív emlődaganat sejtekben és betegekben funkcionális genomikai mószerek alkalmazásával. Eredményeink azt mutatják, hogy a COUP-TFII, mint koregulátor jelen van az ERα-mediált transzkripciós komplexben, és hatással van ERα célgének kifejeződésére. Továbbá a COUP-TFII magas expressziós szintje jobb túléléssel korrelál ER-pozitív luminális A fenotípussal rendelkező betegekben. A COUP-TFII cisztromját egyéb daganatsejtekben is megvizsgálva, azt találtuk, hogy a COUP-TFII az adott sejt-típusra jellemző mester transzkripciós faktorral lokalizálódik együtt. Különböző eredetű sejtekben közös COUP-TFII kötőhelyeket azonosítottunk a VEGFA gén szabályozó régióiban. Emlődaganat sejtekben a COUP-TFII gátló hatással van ennek az angiogenikus génnek a kifejeződésére. Különböző daganatos betegek túlélésének vizsgálata során azt találtuk, hogy a COUP-TFII magas expressziós szintje jobb túléléssel korrelál. Összességében elmondhatjuk, hogy a COUP-TFII magreceptor jelenlétének tumorszuppresszor hatása van mester transzkripciós faktorok mellett különböző daganatos betegségekben.Tétel Szabadon hozzáférhető Súlyos monogénes betegségek prenatális és postnatális genetikai diagnosztikai kihívásaiKoczok, Katalin; Balogh, István; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; DE--Általános Orvostudományi Kar -- Laboratóriumi Medicina Intézet Klinikai Genetikai TanszékA bemutatott tanulmányokban súlyos monogénes betegségek prenatális és postnatális molekuláris genetikai diagnosztikájának néhány speciális kihívást jelentő aspektusát vizsgáltuk. Az első vizsgálatsorozatban három molekuláris genetikai teszt anyai sejt kontaminációra való érzékenységének meghatározását végeztük el. A Sanger DNS szekvenálás esetén a szignifikáns anyai sejt kontamináció szint 5-30%-nak adódott. Az MLPA teszt esetén ≥40% anyai DNS kontamináció interferált a ’magzati’ genotipizálással. A piroszekvenálás igen érzékenynek bizonyult, 1% anyai sejt kontamináció kimutatása is lehetséges volt. A második tanulmányban egy 14 hónapos fiúgyermek Duchenne/Becker-izomdystrophia irányú többszintű genetikai kivizsgálását végeztük el. Az elsővonalbeli tesztként elvégzett MLPA teszt a 4. exon delécióját mutatta, melyet más módszerrel megerősíteni nem tudtunk. A DMD gén teljes kódoló régiójának szekvenálása egy új pontmutáció (c.227A>T, p.Asn76Ile) jelenlétét igazolta, mely a dystrophin fehérje N-terminális aktinkötő doménját érinti. In silico analízisek alapján a mutáció feltehetően destabilizálja az N-terminális aktinkötő domént. A dystrophin fehérje immunhisztokémiai vizsgálata BMD-t valószínűsített. A harmadik tanulmányunkban 13 magyar SLO szindrómás beteg molekuláris genetikai adatait, biokémiai és klinikai jellemzőit foglaltuk össze. Minden esetben jelentősen emelkedett szérum 7-DHC koncentrációt mértünk. A mutáció detektálási ráta 95,8% volt. Magyarországon három allél (p.Trp151*, c.964–1G>C és p.Val326Leu) felelős a betegséget okozó genetikai eltérések 54%-áért. Egy esetben null mutációra homozigóta genotípus, míg a további esetekben összetett heterozigótaság igazolódott. Egy új misszensz mutációt is detektáltunk (c.374A>G, p.Tyr125Cys), melyet valószínűleg patogénként kategorizáltunk.Tétel Szabadon hozzáférhető HIV-2: insight into viral replication dynamics, evolutionary rate and role in dual HIV infectionSzojka, Zsófia Ilona; Tőzsér, József; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; DE--Általános Orvostudományi Kar -- Biomémiai és Molekuláris Biológiai IntézetVizsgálataink célja az volt, hogy jobban megértsük a HIV-2 vírus replikációjának dinamikáját, a vírus fertőzőképességét és a dupla fertőzésben betöltött szerepét. A HIV-1 és HIV-2 dupla fertőzés modellezésére és tanulmányozására sejtkultúrás modellrendszert alkalmaztunk és megállapítottuk, hogy a HIV-2 Vpx jelenlétében a HIV-1 infektivitása szignifikánsan.Ez a gátló hatás megmutatkozott a 2-LTR junkciók számának csökkenésében, feltehetőleg a kapszid fehérje (p24) termelésben és a HIV-1 reverse transzkriptáz aktivitás csökkenésében egyaránt lecsökkent. A HEK293T sejtekhez hasonlóan,az aktivált és differencált THP1 monocyta sejteken is a Vpx HIV-1 „infektivitással” szembeni gátló hatását észleltük. Továbbá vizsgáltuk a a HIV-2 Tat N-terminális s régiójában lévő Y44A mutáció hatását. Eredményeink arra engednek következtetni, hogy az Y44A mutáció negatív hatással van a fertőzőképességre, a HIV-2 RT expressziójára és stabilitására. Iletve vizsgáltuk, milyen kapcsolat figyelhető meg a HIV-2 vírus evolúciója és a betegség progressziója között. Megállapítottuk, hogy a CD4% szint és ennek csökkenésének kapcsolatban áll a HIV-2 evolúciós rátával és a vírus evolúciója sokkal gyorsabb a gyors progressziót mutató betegek esetén. Eredményeink lehetőséget nyújtanak a HIV dupla fertőzés megértésére; a HIV-2 evolúciós ráta és a betegség progresszió kapcsolatára és a Tat vírus replikációban betöltött szerepére.