Molekuláris Sejt- és Immunbiológia Doktori Iskola

Állandó link (URI) ehhez a gyűjteményhez

https://hdl.handle.net/2437/31600

Általános Orvostudományi Kar

Molekuláris Sejt- és Immunbiológia Doktori Iskola
(vezető: Dr. Balogh István)

Orvostudományi doktori tanács

D183

tudományág:
- elméleti orvostudományok

Böngészés

Megjelenítve 1 - 20 (Összesen 125)

Korlátozottan hozzáférhető
Structural and Functional Characteristics of Transglutaminase 2 in Relation to Signal Transduction and Coeliac Disease
(2008) Király, Róbert; Fésüs, László; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; DE--OEC--Általános Orvostudományi Kar--Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet
Coeliac disease (GSE) is the most frequent, chronic small intestinal autoimmune disorder with broad spectrum of manifestation in genetically predisposed persons. The main autoantigen of GSE is the transglutaminase 2 (TG2). We identified that the specific TG2 autoantibodies also exist in small-bowel antibody deposits in seronegative patients. Our study confirms the hypothesis that the anti-TG2 autoantibodies are specific markers of GSE and are present in every coeliac patient. Our finding raises the possibilities that TG2 and anti-TG2 autoantibodies can play important role in pathogenesis of GSE. We found that immunoglobulins from patients with severe malabsorption enhanced the transglutaminase activity of TG2. This activating effect was dose-dependent, most pronounced with immobilised glutamine-acceptor substrates, and correlated inversely with the basal specific activity of the enzyme and with dietary treatment. A similar activation could be demonstrated also with the TG2-specific fraction of autoantibodies and in transamidation activity assays which use fibronectin-bound TG2 and thereby mimic in vivo conditions. These results suggest that coeliac antibodies may stabilise the enzyme in a catalytically advantageous conformation. GTPase activity of TG2 decreased in the presence of antibodies raising the possibility that inhibition of GTPase activity may affect cellular signalling. Since the TG2 could be a key player in GSE and the Ca2+-dependent function and structure relations were not completely characterised we examined the Ca2+-binding properties of TG2. We identified 5 non-canonical Ca2+-binding sites, out of which 3 by homology with known Ca2+-binding sites of TG3 and Factor XIIIa and the other 2 with negative surface potentials using site directed mutagenesis. CD spectroscopy, antibody binding assay and GTPase activity measurements indicated that the amino acid substitutions did not cause major structural alterations. 45Ca equilibrium dialysis and isothermal calorimetric titration showed that the wild type and active site deleted enzymes bind 6 Ca2+. Each mutant binds less Ca2+ than these and mutation of a site resulted in the loss of more than one Ca2+ ions. All mutants were deficient in transglutaminase activity and similarly to the wild type enzyme GTP inhibited remnant activities. Similarly to the wild type form GTPase activities of the mutants were sensitive to Ca2+-concentration except in case of S4 and S5 which exhibited increased GTPase activity. Testing reactivity of Ca2+ mutants with coeliac autoantibodies revealed that the S4 site strongly influenced antigenicity and the interaction of autoantibodies with TG2. ----- A coeliakia (GSE) a vékonybél leggyakoribb, genetikailag fogékony egyénekben kialakuló krónikus autoimmun betegsége, melynek igen sokféle klinikai manifesztációja lehet. A GSE fő autoantigénje az egyedülállóan sokarcú transzglutamináz 2 (TG2). Kimutattuk, hogy az anti-TG2 antitest lerakódások negatív szerológiai vizsgálatok esetén is jelen vannak a vékonybélben, megerősítve azt a hipotézist, hogy a betegekben mindig képződnek anti-TG2 autoantitestek. Ezért jogosan vetődik fel a lehetőség, hogy a TG2 és az anti-TG2 antitestek fontos szerepet játszanak a coeliakia patogenezisében illetve manifesztációjában. Munkánk alapján a súlyos felszívódási zavarral rendelkező betegek autoantitestei dózisfüggő módon fokozzák a TG2 transzglutamináz aktivitását. Hasonló aktiválás volt megfigyelhető egy in vivo körülményeket utánzó tesztben, ahol a fibronektinhez kötött TG2 transzglutamináz aktivitását vizsgáltuk specifikus TG2 ellenes autoantitestekkel. Eredményeink alapján valószínűsíthető, hogy a coeliakiás autoantitestek stabilizálják az enzimet a katalitikusan kedvező konformációban. Az autoantitestek gátolják az enzim GTPáz aktivitását, így befolyásolhatják a TG2 jelátviteli funkcióit is. A TG2 coeliakia patomechanizmusában lévő szerepének további tisztázásához megvizsgáltuk az enzim Ca2+-kötő sajátságait, mivel annak Ca2+-függő funkciója és az e mögött lévő szerkezeti tulajdonságok befolyásolhatják az autoantitestek kötődését a TG2-hoz. 45Ca equilibrium dialízis és izoterm mikrokalorimetriás titrálás azt mutatta, hogy a vad típus és a keresztkötő aktivitásra nem képes aktív hely mutáns egyaránt 6 Ca2+-t köt. Homológ modellezés, negatív felületi potenciálú helyek kiválasztása és irányított mutagenezis segítségével azonosítottunk 5 különböző Ca2+-kötő (S1-S5) helyet, melyek szerkezetileg nem kanonikus Ca2+-kötő helyek és multiplex kötésre is képesek lehetnek. Minden ezeket érintő mutáns Ca2+-kötő képessége csökkent, annak ellenére, hogy CD spektroszkópia, antitest kötési vizsgálat és GTPáz mérés alapján elmondhatjuk, hogy ezek a mutációk nem okoztak szignifikáns szerkezeti változást. Egy kötőhely mutációja egynél többel csökkentette a kötött Ca2+-ok számát, ami a kötőhelyek közötti kooperativitásra utal. Az S1 hely nagy affinitású kötőhely, a többi alacsony affinitással köti a Ca2+-t. Minden mutánsnak csökkent a transzglutamináz aktivitása, ami GTP-vel gátolható volt. A vad típushoz hasonlóan a GTPáz aktivitások Ca2+-függőek voltak kivéve az S4 és S5 mutánsokat, amelyeknek jelentősen emelkedett a GTPáz aktivitása. Az S4 hely jelentősen befolyásolja a TG2 antigenitását, azaz szerkezeti kapcsolatban van a TG2 coeliakiában fontos epitópjaival és ez az új ismeret lehetőséget ad azok pontosabb lokalizálására.
Korlátozottan hozzáférhető
A P-glikoprotein transzport funkciójának gátlása konformációs állapotának és topológiai viszonyainak modulációjával
(2008) Fenyvesi, Ferenc; Szabó, Gábor; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; DE--OEC--Általános Orvostudományi Kar -- Biofizikai és Sejtbiológia Intézet
1. A munkacsoportunk által korábban kidolgozott AKT teszttel további Pgp modulátorokat és szubsztrátokat vizsgáltunk meg. A teszt segítségével a vegyületek a már korábban felállított AKT-pozitív és AKT-negatív csoportokba egyértelműen besorolhatóak, így megállapíthatjuk, hogy a szubsztrátok dichotómiája nagyobb számú vegyületet összehasonlítva is kimutatható. 2. Kimutattuk, hogy az UIC2 mAt részleges Pgp gátlása AKT-pozitív modulátorokkal teljessé fokozható, és a gátlás a modulátorok kimosása után is megmarad. A gátló hatású mAt kötődéshez alacsony, önmagában még hatástalan modulátor koncentráció elégséges. 3. Az UIC2 és AKT-pozitív modulátor hatására kilakuló Pgp gátlás a rezisztens sejtek daunorubicinnel szembeni érzékenységében is megnyilvánult. A revertálás az antitest és a modulátor együttes alkalmazásakor bizonyult a legerősebbnek. 4. Megvizsgáltuk a modulátorok hatására kialakuló UIC2 mAt kötődés növekedés lehetséges okait. Bebizonyosodott, hogy a disszociációs állandó kismértékű változása mellett főként a kötőhelyek számának nagymértékű növekedése okozza a megemelkedett antitest kötödést. 5. az UIC2 gátlást in vivo tesztelve kimutattuk, hogy az antitest eljut és kötődik a tumor teljes térfogatában a tumorsejtek felszínén elhelyezkedő Pgp molekulákhoz és a kötődés az AKT-pozitív modulátor CSA kis dózisával fokozható. A kialakuló kötődés a tumorsejtekben daunorubicin akkumulációt idéz elő, ami az antitestkötődés mértékével összhangban áll. 6. Az MDR sejtek koleszterin kivonással illetve szaturációval modulált membránjában a Pgp-k raft asszociációja a koleszterinszinttel párhuzamosan változott. Koleszterin depléció hatására a Pgp-k funkciója gátolt, míg szaturáció következtében az internalizáció fokozásával a transzportban résztvevő molekulák száma csökkent. 7. A koleszterin modulálás a sejtek életképességének nagymértékű csökkenéséhez vezetett, de nem járt együtt az élő sejtek ATP-szintjének változásával. A Pgp gátlást ennek megfelelően nem a kezelés toxikus volta, hanem a koleszterintartalom változásából fakadó membránkörnyezeti tényezők megváltozása okozhatja. ----- 1. We have tested several Pgp transported drugs by the antibody competition test (ACT). The tested compounds could be clearly classified into the ACT-positive or ACT-negativ groups, therefore we can conclude that this kind of dichotomy can be a general feature of many Pgp substrates/modulators. 2. The partial inhibition of the pump by the UIC2 mAb could be increased by ACT-positive agents to near-complete inhibition that prevailed after the removal of the drugs. The inhibitory binding of UIC2 could be induced by low, in itself ineffective concentrations of the modulators. 3. The coadministration of UIC2 mAb and these modulators could more effectively reduce the resistance of MDR cells than either the mAb or the modulators alone, also reflected in the in vitro cytotoxicity test. 4. We have investigated the possible causes of increased binding of UIC2 by the transported drugs (UIC2-shift). We have found that besides a small change in the dissociation constant the elevated UIC2 binding is brought about by the increase in the number of available binding sites. 5. The UIC2 mAb reached and was bound to the cell surface Pgps of solid tumors in vivo. The amount of bound UIC2 could be increased by the coadministration of low-dose, ACT-positive cyclosporin A. The mAb binding elicited increased daunorubicin accumulation in tumor cells in vivo and this was accompanied by an elevated daunorubicin uptake. 6. The raft association of Pgps could be decreased by membrane cholesterol depletion or increased by cholesterol saturation in MDR cells. Cholesterol depletion caused Pgp inhibition in living cells, while cholesterol saturation induced an increased rate of Pgp internalization. 7. Although cholesterol modulation was accompanied by decreased cell viability, we didn’t observe a lowered ATP content in the dye-excluding, apparently viable cells that might have been the result of nonspecific membrane permeabilization. Thus, we could confirm that Pgp inhibition was effected by the altered lipid environment that perturbed drug transport efficiency and not to the toxicity of the cell treatment.
Korlátozottan hozzáférhető
Humán immundeficiencia vírus 1 proteáz ellenes makromolekuláris inhibitorok tervezése, előállítása és jellemzése
(2008) Miklóssy, Gabriella; Bagossi, Péter; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; DE--OEC--Általános Orvostudományi Kar--Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet
A doktori értekezésemben bemutatott munkáimban célul tűztük ki egy nagy áteresztőképességű és gyors mikrotiter lemez alapú fluorometriás módszer kidolgozását, mely alkalmas különböző retrovirális proteázok aktivitásának és gátlási állandóinak közvetlen összehasonlítására, illetve részben ezen módszerre alapozva, új típusú makromolekuláris HIV-1 PR inhibitorok tervezését, előállítását és tesztelését. Összefoglalásul elmondhatjuk, hogy a munkánk során kidolgozott fluorometriás módszer egy jó alternatíva lehet a hagyományos HPLC-alapú módszer mellett, mivel gyors és egyszerre nagy számú minta kezelését teszi lehetővé. Módszerünket a hagyományos HPLC-alapú módszerrel validáltuk vad típusú HIV-1 és HTLV-1 proteázok, valamint EDANS és DABCYL csoportokat hordozó új tervezésű szubsztrátok felhasználásával. Kidolgoztunk egy új eljárást a fluoreszcens donor és akceptor csoportokat egyszerre hordozó szubsztrátok mérése esetén fellépő belső szűrő hatás korrekciójára. Az új módszer segítségével összehasonlítottuk a HIV-1 és a HTLV-1 proteázok gátlási profilját néhány, már klinikai használatban lévő HIV-1 PR ellenes és néhány, a munkacsoportunk által tervezett HTLV-1 PR inhibitor felhasználásával. Módszerünket későbbiekben sikerrel alkalmaztuk más vad típusú és mutáns retrovirális proteázok esetében is (Kádas és mtsai, 2004; Fehér és mtsai, 2006; Sperka és mtsai, 2007). A továbbiakban a szubsztrátkötő helyen hidrofil, hidrofób és töltött aminosavakat hordozó mutáns HIV-1 proteázokat terveztünk és vizsgáltunk. A mutációk in silico megtervezése után elkészítettük és megtisztítottuk a fehérjéket, majd teszteltük azok in vitro és sejtkultúrás kísérletekben mutatott gátló hatását. A töltött aminosavakat hordozó mutánsaink, amelyek a HIV-1 proteáz ellen tervezett makromolekuláris inhibitorok egy új generációját képviselik, dózisfüggő, specifikus, transz domináns gátló hatást mutattak kísérleteinkben. Elsőként detektáltuk egy vad típusú retrovirális proteáz és egy transz domináns negatív mutáns heterodimerizációját NMR spektroszkópiával. Az Asp25Arg és a Gly49Glu csere egyéb retrovirális proteázokban is gátló hatást eredményezhet a vad típusú proteázzal szemben, mivel ezen aminosavcserék célpontjai a hidrolitikus aktivitáshoz elengedhetetlen katalitikus aszpartátok. ----- We have developed a high throughput microtiter plate fluorescent assay which can be a good alternative to the traditional HPLC-based protease assay, since it is faster and is able to measure several parallel samples. Our assay was validated by using the traditional method and applied to HIV-1 and HTLV-1 proteases. Several new fluorescent substrates containing EDANS/DABCYL groups were designed and tested. We have also developed an alternative method for the inner filter correction. Inhibition profiles of HIV-1 and HTLV-1 PRs were compared using various clinically used HIV-1 PR inhibitors and new HTLV-1 PR inhibitors were also designed and tested. Later, the new method has also been applied successfully for additional retroviral proteases. Furthermore, we have designed and investigated defective HIV-1 proteases which contained mutations in the active site and in the substrate binding site. After the in silico mutagenesis, we prepared and purified selected proteins for in vitro as well as in cell culture experiments to determine their inhibitory effect on wild-type HIV-1 PR. Mutants containing charged residues showed dose-dependent, specific, trans-dominant inhibitory effect in our experiments, and they represent a new generation of macromolecular inhibitors against HIV-1 PR. Heterodimerization could be detected, for the first time, between a wild-type retroviral PR and trans-dominant negative mutants by NMR spectroscopy using our novel hydrophilic constructs and our facile protein folding protocol. The Asp25Arg and the Gly49Glu mutations introduced into analogous positions of other retroviral PRs may exert a similar inhibitory effect on the corresponding wild-type PR. These residues target the catalytic aspartate, thus it may be considered a general strategy for all retroviral PRs.
Korlátozottan hozzáférhető
A coeliakiához társuló kóros antitestválaszok immunológiai összefüggéseinek és specificitásának tanulmányozása
(2008) Nemes, Éva; Korponay-Szabó, Ilma; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; DE--OEC--Általános Orvostudományi Kar--Gyermekklinika
Az európai populáció legalább 1%-át érintő CD az egyik leggyakoribb autoimmun betegség. Felismerésének fő eszköze a betegségre jellemző szerológiai tesztek alkalmazása. A coeliakia specifikus autoantitestek a TG2 ellen irányulnak. Vizsgálataink során a betegek saját vörösvérsejtjeiben található TG2 felhasználásán alapuló, laboratóriumi felszerelést és jártasságot nem igénylő módszert alkalmaztuk a CD diagnosztikájában. A helyszíni gyorsteszt segítségével az eredmények gyorsabban állnak a vizsgáló orvos rendelkezésére és a teszt nem orvos egészségügyi személyzet vagy maga a beteg által otthon is elvégezhető. Az ujjbegyből nyert teljes vérrel végezhető gyorsteszt a vérmennyiséget és a vérvételi módszert tekintve is kisebb megterheléssel alkalmazható kisgyermekeknél, mint a hagyományos, perifériás vénából történő vérvétel a savóvizsgálatokra. A gyorsteszttel végzett ellenőrzés és a kóros eredmény alapján végzett intervenció rövidebb időt igényel és csökkenti az egyéb irányú invazív vizsgálatok számát, ugyanakkor javítja a diétás fegyelmet és betegek kezeltségi állapotát, valamint lehetővé teszi a családtagok és a populáció minimálisan invazív szűrését. A coeliakiára jellemző HLA-DR3:DQ2 haplotípusok befolyásolják a T-lymphocyták aktivációját és gyakorlatilag az immunrendszer cytokin termeléssel összefüggő minden aspektusát. Azt vizsgáltuk, hogy a protein természetű HBsAg-re adott protektív ellenanyag termelésben megnyílvánuló lymphoproliferatív válasz sérül-e coeliakiában. Eredményeink arra utalnak, hogy a HLA-DQ2 hordozás önmagában nem jár a hepatitis B vakcinációra adott elégtelen humorális immunválasszal. Az ellenanyagválasz csökkent volt a még fel nem ismert és ezért még nem kezelt CD betegekben, azonban a prospektíven immunizált, glutenmentes diétát tartókban normális immunválasz alakult ki. A non-responder állapot tehát nem állandó kísérő jelensége a betegségnek, ezért a revakcinációt a gluten eliminációja után érdemes elvégezni. Nem találtunk vizsgálatunkban összefüggést a hepatitis B vakcinációra adott immunválasz és a betegek haptoglobin polimorfizmusa között. A coeliakiára nem specifikus szerológiai vizsgálatok alkalmazása napjainkban is vitatott. Vizsgálataink során kerestük a non-organ specifikus autoantitestek és az anti-glycan antitestek diagnosztikai értékét és ezek összefüggését a glutenmentes diétával. Az eredményeink azt mutatják, hogy jelenlétük kapcsolatban van a betegség aktivitásával, ami egyrészt a szöveti károsodás, másrészt a mikrobiális antigénekkel szembeni tolerancia elvesztésének a következménye. Egyéb autoimmun betegség hiányában ezek a másodlagos antitestek a gluten eliminációjára eltűnnek a keringésből. Más célból végzett vizsgálatuk pozitív eredmény esetén felveti coeliakia fennállását is, ezért javasolt ilyen esetekben a betegségre specifkus antitestek szűrő vizsgálata. Vizsgáltuk még az anti-CMV ellenanyagok prevalenciáját krónikus hasmenésben, és azt találtuk, hogy jelenlétük nem függött össze a coeliakiával. Értekezésemben a CD-ben alkalmazható betegségre specifikus és egyéb kiegészítő szerológiai vizsgálatok felhasználásának különböző módjait kívántam bemutatni. Alkalmazásuk segítséget nyújt mind a betegség diagnózisának felállításában, mind a diétás intervenció követésében, valamint a fertőző betegségek elleni prevencióban is. A patomechanizmusban betöltött szerepük további kutatást igényel. ----- Celiac disease (CD) which affects at least one percent of the population in Europe is one of the most frequent autoimmune diseases. The main tools for diagnosing the disease are specific serological tests followed by confirmatory small intestinal histology in positive cases. Celiac specific autoantibodies target the enzyme tissue transglutaminase (TG2). In our studies, we showed that CD can be detected by a rapid method based on the use of TG2 antigen in the patients’ own red blood cells, which does not need either laboratory equipment or skills. The CD rapid test enables the doctor to get the results more quickly. Furthermore, it can be done by the patient himself at home. Whole blood fingertip sampling requires less blood and it is less stressful for small children than traditional venous blood sampling for serum examinations. Screening by the onsite rapid test and biopsy intervention following a positive result need less time and diminish the number of other invasive tests. Rapid antibody determinations also improve the dietary compliance and the status of the patients. Family members and the population can also be screened by a minimally invasive method in this way. HLA-DR3:DQ2 haplotypes that are specific to CD affect the activation of T lymphocytes and practically all aspects of the immune response related to cytokine production. In our study, we examined whether production of protective antibodies to the protein-like HBsAg is diminished in CD. We found that HLA-DR3:DQ2 carriers do not necessarily have insufficient humoral immune response to HBV vaccination. Specific antibody production was lower in undiagnosed and therefore untreated CD patients. However, patients prospectively immunized on a gluten-free diet showed normal immune response. We concluded that the non-responder status is not permanent in CD, so revaccination is indicated after gluten elimination. No correlation was found between the immune response to the HBV vaccination and haptoglobin polymorphism of the patients. The use of serological tests that are non-specific to CD has long been disputed. Our study also evaluated the diagnostic value of non-organ specific autoantibodies and anti-glycan antibodies as well as how they are affected by the gluten free diet. We found that their presence depends on the activity of CD. That is partly due to tissue damage and partly to the loss of tolerance to microbial antigens. The above antibodies seem to be secondary, and in the absence of other autoimmune diseases, they disappear from blood when gluten is eliminated. When they are present or found accidentally during other examinations, CD should be suspected, however use of these tests is not sensitive enough to find all CD patients. The prevalence of anti-CMV antibodies was also studied in patients with chronic diarrhoea, but their presence was not found to be related to CD. The aim of my thesis was to present the different ways how disease specific TG2-targeted antibody tests and other serologic tests can be applied in clinical settings and how are they immunologically interrelated. They are useful to facilitate the diagnosis of CD and the monitoring of the dietary intervention, as well as the prevention of contagious diseases. The role they play in the pathomechanism of CD needs further studies.
Korlátozottan hozzáférhető
Characterization of Transglutaminase 2 Substrate Specificity Using Phage Display Technology, Logistic Regression Analysis and Intrinsic Disorder Examination
(2008) Csősz, Éva; Fésüs, László; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; DE--OEC--Általános Orvostudományi Kar--Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet
Transglutaminase 2 (TG2) catalyzes the Ca2+-dependent post-translational modification of proteins via formation of isopeptide bonds between their glutamine and lysine residues. The enzyme has more than 130 reported substrates but the exact mechanism by which its substrates are selected is still an enigma. As a first approach, we collected the known transglutaminase substrates into TRANSDAB Wiki (http://genomics.dote.hu/wiki), the transglutaminase substrate database and using the deposited information we attempted to find out the rules of TG2 substrate selection. To study the preferred sequences around substrate glutamines we adapted the phage display technique selecting the glutamine donor substrates from a random heptapeptide library via their binding to recombinant TG2. The pQx(P,T,S)l consensus motif around glutamines was established, which is consistent with so far identified substrates. Database searches showed that several proteins contain peptides similar to the phage-selected sequences, and the N-terminal glutamine-rich domain of SWI1/SNF1-related chromatin remodeling protein was chosen for detailed analysis. Mass spectrometry-based studies of a representative part of the SWI1/SNF1-related chromatin remodeling protein p270 indicated that it was modified by TG2. Along with phage display technique in silico methods were used to compare the sequence context of substrate and non substrate residues to get a better understanding about principles of substrate selection of TG2, but none of the results could give a full explanation how TG2 selects the different substrate glutamine and lysine residues. Using the structural information on TG2 substrate proteins listed in TRANSDAB Wiki database a slight preference of TG2 for glutamine and lysine residues situated in turns could be observed. When the spatial environment of the favored glutamine and lysine residues were analyzed with logistic regression the presence of specific amino acid patterns were identified. Using the occurrence of the predictor amino acids as selection criteria several polypeptides were predicted and later identified as novel in vitro substrates for TG2. Studying the sequence of TG2 substrate proteins lacking available crystal structure the strong favorable influence on substrate selection of the presence of substrate glutamine and lysine residues in intrinsically disordered regions also could be revealed. The collected sequence and structural data have provided novel understanding of how this versatile enzyme selects its substrates in various cell compartments and tissues and suggest that instead of the strict linear sequences spatial features must be considered as well to explain the complex physico-chemical interaction between TG2 and its substrates. It seems that in case of this enzyme a divergent substrate recognition system has evolved where beside the linear sequences, spatial structural features and the presence of intrinsic disorder can be significant in substrate selection. This may reflect the unique nature of how transglutaminase 2 works in almost all cellular compartments, including the cell surface and extracellular space. It is capable to perform diverse biochemical reactions, such as signal transduction through its GTPase activity, ATP hydrolysis, protein disulphide isomerase activity, integrin and fibronectin binding, while its major biochemical function is modifying protein bound glutamine residues whenever it becomes feasible. The need of substrate selection for this classical transglutaminase function may arise under very different circumstances making the flexible recognition mechanisms detailed in this work advantageous. ----- A 2 típusú transzglutamináz (TG2) a fehérjék Ca2+-függő poszttranszlációs módosítását katalizáló enzim, amely izopeptid kötéseket hoz létre a glutamin és lizin oldalláncok között. A TG2 több mint 130 azonosított szubsztráttal rendelkezik, de a pontos szubsztrát felismerési mechanizmus még nem ismert. A szubsztrátpreferencia vizsgálatához összegyűjtöttük az eddig azonosított TG2 szubsztrátokat és létrehoztuk a TRANSDAB Wiki (http://genomics.dote.hu/wiki) transzglutamináz szubsztrát adatbázist. A TG2 által preferált szekvenciák vizsgálatára fág bemutató rendszert alkalmaztunk és a random heptapeptideket bemutató könyvtárból kiszűrtük a rekombináns TG2-höz kötődő fágokat. A kapott peptidek szekvenciájában leggyakrabban előforduló, a szubsztrát glutaminok környezetére jellemző pQx(P,T,S)l konszenzus motívum összhangban van az eddig azonosított szubsztrátok szekvenciájával. A pQx(P,T,S)l motívum jelenléte alapján szubsztrátnak jósolt SWI1/SNF1 kromatin remodeling faktor N-terminális részletét megszintetizáltuk és bebizonyítottuk, hogy a TG2 felhasználja szubsztrátként. Eredményeink azt sugallják, hogy a kombinatórikus módszerrel meghatározott szekvenciáknak in situ relevanciája lehet. Az fág bemutató rendszer mellett in silico módszereket alkalmazva is megpróbáltuk feltérképezni a szubsztrát glutamin illetve lizin oldalláncok környezetében jelen levő aminosav oldalláncok fontosságát, de sem az in vitro sem az in silico megközelítés nem adott teljes magyarázatot a TG2 szubsztrátspecificitására. A TRANSDAB Wiki adatbázisban található szerkezeti információkat felhasználva megkíséreltünk fényt deríteni arra, hogy milyen térbeli kritériumok szerint válogatja ki a TG2 szubsztrátjait. A glutamin illetve lizin oldalláncok térszerkezeti elemzéséből nyert nagy mennyiségű adatot logisztikus regressziós analízis segítségével összehasonlítottuk és olyan prediktor aminosavakat kerestünk, amelyek meghatározzák, hogy mely oldalláncokat módosítja a TG2. A prediktor aminosavak jelenlétét vagy hiányát, mint szelekciós kritériumokat felhasználva sikerül három új TG2 szubsztrátot azonosítani. Azokban a fehérjékben, amelyek nem rendelkeznek kristályszerkezettel a TG2 szubsztrátspecifictásának egyik meghatározó tényezője a rendezetlenség jelenléte; a TG2 azokat az oldalláncokat használta fel nagyobb valószínűséggel szubsztrátként, amelyek rendezetlen régióban helyezkedtek el. Az összegyűjtött szekvencia és szerkezeti adatok új megvilágításba helyezik e változatos enzimaktivitással rendelkező fehérje szubsztrátspecificitását. A sejtben a TG2 számos kompartmentben fordul elő és transzglutaminázként működve változatos szubsztrát fehérjéket módosít, de rendelkezik GTP/ATPáz aktivitással, kinázként, protein diszulfid izomerázként is működhet vagy a sejtek felszínén integrinhez vagy fibronektinhez kapcsolódhat. A szubsztrátok felismeréséhez szükséges komplex fiziko-kémiai interakciók megértéséhez nem elég csak a lineáris szekvenciában rejlő információkat használni, hanem szükség van a térbeli szerkezetben kódolt információkra és a rendezetlenség jelenlétének vizsgálatára.
Korlátozottan hozzáférhető
Role of Tissue Transglutaminase in Phagocytosis of Apoptotic Cells by Macrophages
(2009) Tóth, Beáta; Szondy, Zsuzsa; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; DE--OEC--Általános Orvostudományi Kar --
The clearance of apoptotic cells by macrophages plays a crucial role in tissue repair, suppressing inflammation and regulating immune responses. Transglutaminase 2 (TG2) is a protein crosslinking enzyme with diverse biological functions. Among many others it acts as an integrin β3 co-receptor. We have previously shown that in TG2-/- mice the in vivo clearance of apoptotic cells is defective leading to development of SLE like autoimmunity. This was partially related to a defect in TGF-β activation, as TGFβ released by macrophages digesting apoptotic cells promotes phagocytosis of apoptotic cells and inhibits inflammatory responses. In the present work the role of TG2 was studied in details in the engulfment of apoptotic cells by macrophages. Here we report that TG2 promotes phagocytosis of apoptotic cells by acting on the macrophage cell surface in guanine nucleotide bound form. Besides being a binding partner for integrin β3, a receptor known to mediate the uptake of apoptotic cells via activating Rac1, we also show that TG2 binds milk fat globule EGF-factor 8 (MFG-E8), a protein known to bridge integrin β3 to phosphatidylserine on apoptotic cells. We report that in wild-type macrophages one or two engulfing portals are formed during phagocytosis of apoptotic cells that are characterized by accumulation of integrin β3 and Rac1. In the absence of TG2, although the levels of integrin β3 are enhanced, integrin β3 and consequently Rac1 can not be concentrated and activated at one pole of the macrophage. The defect in the alpha(v)β3 integrin signaling leads to an abnormal actin cytoskelatal organization and the efficient engulfing gate is not formed. Together, our data indicate that TG2 is a new protein member of the phagocytic cup, which together with MFG-8 is required for proper apoptotic cell recognition and integrin β3 signaling. In the present study we also describe a subline of TG2-/- mice, in which integrin β3 expression compensatory increases resulted alone in a high receptor concentration around the apoptotic cells without the requirement for accumulation. The elevated integrin β3 levels were sufficient to overcome the defect caused by the loss of TG2 in the initiation phase of integrin β3 signaling, but a significant accumulation of Rac1 around the apoptotic cells did not occur, and the phagocytosis of apoptotic cells was more severely affected. The lack of Rac1 accumulation was partially related to a defect of PI-3-kinase activation. Our data provide a proof for the concept that the function of TG2 is to stabilize accumulated integrin β3 concentration in the phagocytic cup. ----- A makrofágok által történő apoptotikus sejtek eltakarítása nélkülözhetetlen a szövetek helyrehozásához, a gyulladási folyamatok elkerüléséhez és az immunválasz szabályozásához. TG2 fehérjéket keresztkötő enzim, számos más biológiai funkcióval. Ezek közül az egyik, hogy az integrin β3 koreceptora. Korábban kimutattuk, hogy a TG2-/- egerekben in vivo az apoptotikus sejtek fagocitózisa zavart, amely SLE-szerű autoimmunitáshoz vezet. Ez részben összefüggött a hiányos TGF-β aktivációval, mivel az apoptotikus sejteket emésztő makrofágok által kibocsájtott TGF-β segíti a további apoptotikus sejtek fagocitózisát és gátolja gyulladásos immunválszt. Ebben a munkában a TG2 szerepét vizsgáltuk részleteiben a fagocitáló makrofágok oldaláról. Kimutattuk, hogy a TG2 a makrofág sejtfelszínén, guanin nukleotidkötött formában segíti az apoptotikus sejtek felvételét. Amellett, hogy kötődik az integrin β3 receptorhoz, amelyről ismert, hogy részt vesz az apoptotikus sejtek felvételében, a Rac aktivációján kersztül, kimutattuk, hogy a TG2 köti a MFG-E8, amely egy áthidaló molekula az integrin β3 és a PS között. Kimutattuk továbbá, hogy az apoptotikus sejtek fagocitózisa során a vad típusú makrofágok egy vagy két fagocitáló kaput képeznek, amelyeket integrin β3 és Rac1 felhalmozódásával jellemezhetünk. A TG2 hiányában, bár az integrin β3 szint emelkedik, de az integrin β3 és ennek következtében a Rac1 nem tud a makrofág egy pólushoz koncentrálódni. Az integrin αvβ3 jelátviteli zavar abnormális citoszkeletáris szerkezethez vezet és nem alakul ki egy hatásos fagocitáló kapu. Adataink együttesen jelzik, hogy a TG2 egy új fehérjéje a fagocitáló kapunak, amely az MFG-E8 fehérjével együtt szükséges a helyes apoptotikus sejt felismeréshez és integrin β3 jelátvitelhez. Jelen munkánkban szintén bemutattuk a TG2-/- egerek egy altörzsét, melyben az integrin β3 kifejeződése emelkedett, és a teljes sejtfelszínen tapasztalt magas receptor koncentráció magas receptor szintet eredményezett az apoptotikus sejt körül is, azonban a Rac1 molekula felhalmozódása nem történt az apoptotikus sejt körül, ami még súlyosabb fagocitózis zavart eredményezett. A Rac1 csoportosulásának hiánya részben összefügg a PI-3 kináz aktivációjának zavarával. Adataink bizonyítják, hogy a TG2 feladata az integrin β3 felhalmozódásának stabilizálása a fagocitáló kapuban.
Korlátozottan hozzáférhető
Nuclear receptors modulate immune functions in dendritic cells. The case of vitamin D receptor and the regulation of immune function-related genes
(2009) Széles, Lajos; Nagy, László; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; DE--OEC--Általános Orvostudományi Kar--Belgyógyászati Intézet
Dendritic cells (DCs) are conductors of the adaptive immune system with a capacity to activate naive T-cells and regulate their functions. The integration of environmental signals will lead to at least two distinct, immunogenic and tolerogenic, DC immunophenotypes. How these stereotypic immunophenotypes are achieved at the transcriptional level is not well understood. A member of nuclear hormone receptor family, vitamin D receptor (VDR) is implicated in the development of tolerogenic DC phenotype. We have performed microarray studies to identify transcriptional programs regulated by vitamin D receptor (VDR), retinoic acid receptor (RAR) and the differentiation process in developing DCs. Using these datasets we aimed at clarifying the connection of the VDR-coordinated program to the differentiation process as well as to the RAR-regulated transcriptional program. (1) Previous studies suggested that 1,25-dihydroxyvitamin D3 (1,25-vitD) could inhibit the changes brought about by differentiation and maturation of DCs. However, it has not been explored how 1,25-vitD-regulated genes, particularly the ones bringing about the tolerogenic phenotype, are connected to differentiation. Using the global gene expression analysis followed by comprehensive quantitative PCR validation we could clarify the interrelationship between 1,25-vitD and differentiation-driven gene expression patterns in developing human monocyte-derived and blood myeloid DCs. We found that 1,25-vitD regulates a large set of genes that are not affected by differentiation. Interestingly, several genes, impacted both by the ligand and by differentiation, appear to be regulated by 1,25-vitD independently of the developmental context. Our data collectively suggest that exogenous or endogenously generated 1,25-vitD regulates a large set of its targets autonomously and not via inhibition of differentiation and maturation, leading to the previously characterized tolerogenic state. (2) In our ongoing study we have shown that RAR and VDR initiated similar phenotypic and functional changes. Using microarray analysis we have found that ~50% of 1,25-vitD regulated genes were also regulated by AM580 (RAR agonist) at the late stage of DC differentiation. We aim at identifying the potential molecular mechanisms that may be responsible for this phenomenon. Most importantly, we would like to identify target genes that are regulated by the same response elements of the two receptors.
Korlátozottan hozzáférhető
Transglutaminase 2 as an Essential Regulatory Factor of Neutrophil Granulocyte Differentiation. Potential Contribution in Retinoic Acid Syndrome
(2010) Csomós, Krisztián; Balajthy, Zoltán; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; DE--OEC--Általános Orvostudományi Kar --
Therapy of acute promyelocytic leukemia (APL) primarily consists of an all-trans-retinoic acid/ATRA-based treatment, which results in terminal differentiation of leukemic cells toward neutrophil granulocytes. However this differentiation-induced therapy is often accompanied by organ infiltration of differentiating leukemic cell leading severe hyper-inflammatory response in lung as an even lethal side effect of ATRA-treatment, called retinoic acid syndrome (RAS). Administration of ATRA leads to massive changes in gene expression in APL cells, including down-regulation of cell proliferation related genes and induction of genes involved in immune functions of neutrophil granulocytes. One of the most induced genes by ATRA in APL NB4 cells is transglutaminase 2 (TG2). We have demonstrated that transglutaminase 2, after its induction, partially translocates into the nucleus, associates to the chromatin and is able to modify nuclear proteins by its acil-transferase activity during the differentiation process. The transglutaminase-catalyzed cross-link content of both the cytosolic and the nuclear protein fractions increased while NB4 cells underwent cellular maturation. Inhibition of cross-linking activity of TG2 by monodansylcadaverin in these cells led to diminished nitroblue tetrazolium (NBT) positivity, production of less superoxide anion, and decreased expression of gp91phox, the membrane-associated subunit of NADPH oxidase. Neutrophils isolated from TG2-/- mice showed diminished NBT reduction capacity, reduced superoxide anion formation, and down-regulation of the gp91phox subunit of NADPH oxidase, compared with wild-type cells. These results clearly suggest that TG2 may modulate the expression of genes related to neutrophil functions and is involved in the process of differentiation of neutrophil. ... ----- A mieloid eredetű neutrofil granulociták differenciálódása a csontvelőben indul, majd az innen kijutó előalakok a keringésben válnak érett funkcióképes sejtekké. A transglutamináz 2 (TG2) egy tiol és Ca2+-függő acil-transzferáz, amely peptidkötésben lévő glutamin γ-karboxamin csoportja és különböző elsődleges aminok, valamint fehérjék lizin oldalláncának ε-amino csoportja közötti kovalens izopeptid kötés kialakulását katalizálja. Az enzim az immunrendszer legtöbb sejtjében kifejeződik és bebizonyosodott róla, hogy számos biológiai folyamatban aktív szerepet játszik (pl. fagocitózis, a sejtek letapadása és vándorlása, látens TGF-β aktiváció stb). Annak ellenére, hogy a neutrofilokról ismert, hogy a differenciálódásuk során az enzim indukálódik és az érett sejtekben nagy mennyiségű aktív enzim mutatható ki, a TG2 ezekben a sejtekben, ill. a hozzájuk köthető immunológiai folyamatokban betöltött szerepe egyelőre tisztázatlan. Korábbi vizsgálataink alapján bebizonyosodott, hogy a promielocita sejtek neutrofil granulocita irányú differenciációja során a TG2 alapvető szerepet játszik az érett sejtek immunológiai tulajdonágainak kifejlődésében. Eredményeink azt mutatják, hogy a TG2 transzlokálódik a sejtmagba és ott keresztkötő aktivitásától függő módon részt vesz a sejtek éréséhez vezető génregulációs folyamatok szervezésében. Jelen értekezés célja a TG2-től függő regulációs események felderítése, valamint az enzim ezen folyamatokban betöltött szerepének tisztázása volt. ...
Korlátozottan hozzáférhető
A C faktor termelő Streptomyces griseus 45H törzs spóraképzésének, patogenitásának és taxonómiai besorolásának vizsgálata
(2010) Kiss, Zsuzsanna; Biró, Sándor; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; DE--OEC--Általános Orvostudományi Kar -- Humángenetika Tanszék
Az C faktor fehérjét, mint extracelluláris szignálmolekulát illetve a morfológiai differenciálódásban és szekunder metabolit termelésben betöltött szerepét régóta tanulmányozzák. Mivel a fehérjét termelő S. griseus 45H törzs eredete kérdéses volt számunkra, megpróbáltuk tisztázni a törzs pontos taxonómiai besorolását. Eredményeink alapján valószínűsítjük, hogy a S. griseus 45H törzset az ugyanabban a laboratóriumban vizsgált S. flavofungini törzs kontaminációjaként izolálták. A 16S rRNS génszekvenciák összehasonlítása és a Southern hibridizáció eredménye alapján a S. griseus 45H és S. falvofungini törzsek teljesen megegyeznek és a S. albidoflavus csoportba tartoznak. Ezért a S. griseus 45H törzs elnevezését S. albidoflavus 45H-ra változtattuk meg... ----- The extracellular signalling protein Factor C and its role in morphological differentiation and in secondary metabolit production have been studied for a long time. Since the origin of the Factor C producer strain, Streptomyces griseus 45H, has often been questioned we made effort to clarify its taxonomic identification. Our recent molecular data in line with previous findings indicates that S. griseus 45H was probably picked up as a laboratory contaminant of the strain of S. flavofungini. Based on 16S rRNA gene sequences and Southern hybridization, S. griseus 45H and S. flavofungini from our culture collection are clearly identified as the same and belong to the S. albidoflavus group. Therefore S. griseus 45H should be named as Streptomyces albidoflavus 45H in the future...
Korlátozottan hozzáférhető
DNS folytonossághiányok vizsgálata Saccharomyces cerevisiae sejtekben
(2010) Hegedüs, Éva; Szabó, Gábor; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; DE--OEC--Általános Orvostudományi Kar -- Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet
Kolónia-képzési teszttel igazoltam, hogy a kromatin fragmentációs jelenséget nem-apoptotikus, 100 %-os életképességű élesztő sejtek mutatják. Logaritmikus és stacioner fázisú S. cerevisiae és S. pombe sejtekből származó, agarózba ágyazott deproteinizált kromatin 20-200 kb-os fragmentációját figyeltem meg S1 nukleáz emésztésüket, urea/hő-denaturációjukat, ill. alkalikus denaturálásukat követően egyaránt. Megállapítottam, hogy mindkét genomban hurok-méretű szakaszokat határoló egyszál folytonossághiányok találhatóak. S. cerevisiae sejteket G1-, S- és G2 sejtciklus fázisban szinkronizálva sem találtam számottevő eltérést a teljes genom fragmentációs mintázatában. Megállapítottam, hogy a hurok-méretű kromatin fragmentáció minden kromoszómára kiterjed S1 nukleáz, ill. urea/hő-denaturálást követően. S. cerevisiae I. kromoszómáján a hurok-méretű fragmentumokat kijelölő nick-ek és ARS szekvenciák egymás tágabb környezetében helyezkednek el. S. cerevisiae esetében kimutattam, hogy a 100-200 tandem ismétlődő, azonos szekvenciájú 9,1 kb-os egységekből felépülő mintegy 1,5 Mb-nyi rDNS klaszter hurok-méretű fragmentációt mutat, az össz-DNS-hez hasonlóan, S1 nukleáz és urea/hő-denaturálás hatására. Ez azt jelenti, hogy átlagosan minden 11. egységen belül fordulnak elő nick-ek – vagyis ezek előfordulását epigenetikai tényezők határozzák meg. rDNS specifikus Southern szonda segítségével térképeztem az rDNS szakaszokon belül a hurok-méretű fragmentációt kijelölő nick-ek helyét. Behatároltam annak a régiónak a helyét az rDNS egységeken belül, ahol a nick-ek előfordulása szabályosságot mutat: ez a RFB-ével esett egybe. Folytonossághiányok és RNS/DNS hibridek kimutatására alkalmas „Ab-Southern” módszert dolgoztam ki. Új elektroforetikus és mikrogyöngy alapú áramlási citometriás módszereket dolgoztam ki. ----- By the colony-forming test, I confirmed that the chromatin fragmentation phenomena observed reflect features of ~ 100 % viable cells. 20-200 kb fragmentation of agarose embedded deproteinized S. cerevisiae and S. pombe chromatin derived from logarithmic or stationery cultures were observed after S1 nuclease digestions and urea/heat- or alkaline denaturation, establishing that there are ss discontinuities marking loop-sized fragments in the genome of both yeast strains. I have not determined differences in the DNA fragmentation patterns of cells synchronized in G1-, S- or G2 phases. I have established that the loop-sized fragmentation can be detected in all of chromosomes of S. cerevisiae or S. pombe after S1 nuclease digestions and urea/heat- denaturations. Nicks and ARS sites exhibited an overall colocalization on chromosome I of S. cerevisiae. The ~1.5 Mb rDNA cluster containing 100 – 200 units of 9.1 kb showed loop-sized fragmentations similar to total DNA, i.e. nicks occur in every 11. unit on the average. The nicks in the rDNA units were mapped by Southern blotting using rDNA specific probes. One of the nicks coincides with a region of RFB. I have developed a new method called “Ab-Southern” to detect discontinuities and RNA/DNA hybrids in DNA molecules. New gelelectrophoretic and flow-cytometric microbead assays have been established as part of my Ph.D. work.
Korlátozottan hozzáférhető
Lipid Signaling and Inflammation in Macrophages and Dendritic Cells
(2010) Törőcsik, Dániel; Nagy, László; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; DE--OEC--Általános Orvostudományi Kar --
DCs respond to changes in their lipid environment by altering gene expression and immunophenotype. Some of these alterations are mediated via the nuclear receptor superfamily. In previous works nuclear receptors such as PPARs, RAR and VDR, that are found to be expressed at high levels in differentiating DCs and are activated upon exposure to various lipids such as fatty acids, retinoids or by active Vitamin D3, were found to support a tolerogenic DC phenotype. Their effect on DC functions involved interaction with stimulatory effects such as TLR ligands (2, 3, 4, and 7) and cytokine productions resulting in a reduced capacity to stimulate T-cell proliferation. Despite the well-characterized role of LXR in macrophage biology little is known about its the contribution to DC biology. In our work we investiagted the role of LXR in dendritic cell differentiation and functions. We carried out a systematic analysis of LXR, activated by synthetic ligands or naturally occurring oxysterols in developing human monocyte derived dendritic cells. We found that LXRs are present and can be activated throughout dendritic cell differentiation in monocyte as well as blood derived DCs. Administration of LXR specific natural or synthetic activators induced target gene expression accompanied by increased expression of DC maturation markers such as CD80 and CD86. In mature DCs LXR activation augmented the production of inflammatory cytokines IL-12, TNFα, IL-6 and IL-8 and resulted in an increased capacity to activate CD4+ T cell proliferation upon ligation with TLR4 or TLR3 ligands. These effects appear to be underpinned by prolonged NFκB signaling. Supporting such an inflammatory role we found that LXR positive DCs are present in reactive lymph nodes from patients with tuberculosis and sarcoidosis and was present also in DCs of tumor associated lymph nodes. In our work based on similar histological findings where PPARγ was induced in monoctyes upon BCG infection we found that PPARγ coordinates lipid metabolism and inflammation in BCG-infected macrophages, potentially affecting mycobacterial pathogenesis. We propose that activation of LXR represents a novel lipidsignaling paradigm that alters the inflammatory response of human DCs, therefore the role for LXR activation of dendritic cells in vivo calls for further studies.
Korlátozottan hozzáférhető
Regulation of retinoids and n-3 PUFAs in atopy
(2011) Mihály, Johanna; Rühl, Ralph; Mihály, Johanna; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; DE--OEC--Általános Orvostudományi Kar -- DE--OEC--Általános Orvostudományi Kar --
Polyunsaturated fatty acids (PUFAs) are present in high concentrations in the human organism and are essential components of various layers of the skin, furthermore they are important precursors of several pro- and anti-inflammatory mediators. Several studies investigated the PUFA composition in atopic patients and healthy volunteers and PUFA levels have been shown to be decreased in atopic dermatitis skin in comparison to healthy skin. Alterations of retinoid metabolism and signaling have been related to several skin diseases including atopic dermatitis (AD), but so far the expression profiles of the genes involved in retinoid homeostasis regulation and metabolism, retinoid receptors and target genes as well as retinoid concentrations have not been investigated in the human skin. In previous studies, in mice, retinoids have been shown to enhance Th2-mediated responses, respectively elevate IgE levels. Our results show that the target gene expression of retinoid receptor regulated pathways is significantly decreased in AD patients. The main retinoic acid synthesizing enzyme, retinal-dehydrogenase 1, was significantly lower expressed in AD patients. Analysis of retinoid concentrations in serum and skin showed comparable all-trans retinoic acid (ATRA) and retinol (ROL) concentrations in AD and healthy serum, but strongly reduced ATRA and ROL concentrations in AD skin in comparison to healthy skin. Our data indicate that retinoid transport, synthesis, concentrations, signaling and homeostasis are severely dysregulated in affected and non-affected human skin biopsies of AD patients in comparison to the skin of healthy volunteers. In the case of PUFAs the missing point was to find out how supplementation of non-sensitized and sensitized mice with DHA-enriched fish oil diet influences the percentile contribution of n-3 / n-6 PUFAs. Significantly increased percentile contributions of docosahexaenoic acid (DHA) and eicosapentaenoic acid (EPA) in case of triacylglycerols, cholesteryl esters and phospholipids, while significantly lower arachidonic acid (AA) levels were observed in the serum of both non-sensitized and sensitized mice fed the DHA-enriched diet. Allergic sensitization was reflected by the decreased EPA/AA ratio in all lipid classes in non-supplemented animals and to a lesser extent DHA-enriched fish oil supplemented mice. Serum IgE levels significantly increased after allergic sensitization both in the group fed the basal diet and the group fed the DHA-enriched fish oil diet, but no significant changes could be observed in between the two diet groups. A többszörösen telítetlen zsírsavak (PUFA) magas koncentrációban vannak jelen az emberi szervezetben és alapvető összetevői a bőr különböző rétegeinek, továbbá számos pro-és anti-inflammatorikus mediátorok prekurzorai. Több tanulmány vizsgálta a PUFA összetételt atópiás dermatitiszes betegek és egészséges önkéntesek esetén, és kimutatták, hogy a PUFA mennyisége csökkent az atópiás dermatitiszes bőrben az egészséges bőrhöz képest. A retinoid metabolizmus és jelátvitel változásait több bőrbetegséggel hozták összefüggésbe, beleértve az atópiás dermatitiszt (AD) is. A retinoid homeosztázisban, szabályozásban és anyagcserében résztvevő gének, a retinoid receptorok és célgének génexpresszióját, valamint a retinoid koncentrációt még nem vizsgálták humán AD bőrben. Egereken végzett korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a retinoidok fokozzák a Th2-mediált válaszokat, illetve IgE-szint emelkedést váltanak ki. Eredményeink azt mutatják, hogy a retinoid receptor által szabályozott útvonalak célgénjeinek génexpressziója jelentősen csökkent az AD betegekben. A fő retinsav szintetizáló enzim, a retinal-dehidrogenáz 1, szignifikánsan alacsonyabban fejeződött ki AD betegek esetében. A retinoid koncentráció elemzése hasonló csupa-transz retinsav (ATRA) és retinol (ROL) koncentrációt mutatott az AD és egészséges szérumban, de szignifikánsan csökkent az ATRA és ROL koncentrációja az AD bőrben az egészséges bőrhöz képest. Adataink azt mutatják, hogy a retinoid transzport, szintézis, koncentráció, jelátvitel és homeosztázis jelentősen diszregulálódott mind az érintett, mind a nem érintett AD bőrbiopsziákban az egészséges önkéntesekéhez képest. A PUFA esetében a hiányzó pont az volt, hogy meghatározzuk, hogyan változik az n-3 ill. n-6 PUFA százalékos összetétele a nem szenzitizált és szenzitizált DHA-dúsított halolaj tápon élő egerek esetében. A dokozahexaénsav (DHA) és eikozapentaénsav (EPA) szignifikánsan emelkedett százalékos kontribúciója volt megfigyelhető a trigliceridek, koleszteril észterek és foszfolipidek esetén, míg jelentősen alacsonyabb arachidonsav (AA) szintet figyeltünk meg a nem szenzitizált és szenzitizált DHA-dúsított halolaj tápon élő egerek szérumában. Az allergiás szenzitizációt a csökkent EPA/AA arány mutatta minden vizsgált lipid osztályban az alaptápon élő egerek esetében, kisebb mértékben a DHA-dúsított halolaj tápon élő egerek esetében. Allergiás szenzitizáció után a szérum IgE szint jelentősen emelkedett mind az alaptápon, mind a DHA-dúsított halolaj tápon tartott egerek esetében, de jelentős változás nem volt megfigyelhető a két csoport között.
Korlátozottan hozzáférhető
Alfa-amilázok termékanalízisen és molekuláris modellezésen alapuló alhelytérképezése és transzglikozidáz aktivitásuk vizsgálata
(2011) Mótyán, János András; Bagossi, Péter; Harangi, János; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; DE--OEC--Általános Orvostudományi Kar -- Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet; DE--TEK--Természettudományi Kar -- Biokémiai Tanszék
A doktori értekezésben bemutatott munka során az aktív centrum térképezés módszerét használtuk a másodlagos kötőhelyeken módosított W279A, W278A/Y380A, W279A/Y380A, Y380A, H395A, H395A/Y380A és Y105A/Y380M AMY1 mutánsok vizsgálatára. Elvégeztük az aktív helyen módosított S48Y, V47A, V47F, V47D, V47K/S48G, V47G/S48D, V47L/S48A és V47I/S48I árpa α-amiláz 1 (AMY1) mutánsok alhelytérképezését. A megbízható alhelytérképek elkészítéséhez szükséges bontási képeket 3−11 tagszámú 2-klór-4-nitrofenil-β-D-maltooligoszacharid (CNP-β-D-MOS) szubsztrátsorozat segítségével határoztuk meg. Az alhelytérképek számításához a SUMA (Subsite mapping of α-amylases) számítógépes programot használtuk. Az AMY1 enzimek bontási képeinek meghatározása során a transzglikozilezési aktivitás növekedését tapasztaltuk, elsőként tanulmányoztuk részletesen az AMY1 és mutánsai transzferáz aktivitását. A reakciókörülmények optimalizálását követően elvégeztük a 4-metil-umbelliferil-α-D-maltooligoszacharidok (MU-α-D-MOS) enzimatikus szintézisét a V47F AMY1 mutáns által katalizált transzglikozilezés reakcióban. A 2−5 tagszámú MU-α-D-MOS szubsztrátokat sikeresen alkalmaztuk egy gyors és egyszerű fluorimetriás eljárásban, a Bacillus stearothermophilus maltózképző α-amiláz, a Bacillus licheniformis α-amiláz és a humán nyál α-amiláz kinetikai paramétereinek meghatározásában. A kidolgozott eljárás megoldást jelenthet a fluoreszcens α-amiláz szubsztrátok előállítására, melyek nem érhetők el kereskedelni forgalomban. Egy olyan számítógépes eljárást dogloztunk ki az α-amilázok vizsgálatára, mely az alhelytérképek molekuláris modellezéssel történő számításán alapul. A módszer kidolgozásához a különböző amilázok irodalmi adatai alapján létrehozott tanító halmazt használtuk, az eljárást a kísérletesen meghatározott és a jósolt értékek közötti korreláció alapján optimalizáltuk. Az ellenőrzéshez az AMY1 V47/S48 mutánsainak adataiból létrehozott ellenőrző halmazt használtuk, és a töltött aminosavak mutációval történő bevezetését tartalmazó mutáns enzimek kivételével szintén jó korrelációt kaptunk. A kidolgozott eljárás a vad típusú és mutáns enzimek homológ modelljeit használja az alhelytérképek Sybyl molekulamodellező szoftverrel történő molekulamechanikai számítására és a SUMA programot az elsődleges kísérletes adatok (BCF) jóslására. Módszerünk felhasználható lehet az α-amilázok szerkezet-funkció összefüggéseinek megértésében és a módosított fehérjék előállítására irányuló vizsgálatok támogatásában. In this work we used the method of subsite mapping to examine the W279A, W278A/Y380A, W279A/Y380A, Y380A, H395A, H395A/Y380A and Y105A/Y380M secondary substrate binding site mutants of AMY1. We mapped the active site of S48Y, V47A, V47F, V47D, V47K/S48G, V47G/S48D, V47L/S48A and V47I/S48I active site mutants of barley α-amylase 1 (AMY1). 2-Chloro-4-nitrophenyl-β-D-maltooligo-saccharides (CNP-β-D-MOS) of degree of polymerizaion (DP) 3−11 were used to determine the bond cleavage frequencies (BCF). Subsite binding energies were calculated using the computer program for subsite mapping of α-amylases (SUMA). Enhanced transglycosylation activity of several mutants of AMY1 was observed during the BCF analysis and this ability was further explored and studied systematically. After optimization of reaction conditions, 4-methylumbelliferyl-α-D-maltooligosaccharides (MU-α-D-MOS) of DP2−5 have been successfully synthesized using V47F active site mutant of AMY1. MU-α-D-MOS were used efficiently as fluorogenic substrates in a fast and simple fluorometric α-amylase assay to determine the kinetic parameters of Bacillus stearothermophilus maltogenic α-amylase, Bacillus licheniformis α-amylase and human salivary α-amylase. Described method may be the solution for preparation of fluorogenic α-amylase substrates which are not commercially available up to now. We developed a computer-aided subsite mapping procedure for α-amylases. A training set of data was collected from the literature using published data, to prepare a test set of data we determined experimentally the BCF-s and calculated the subsite maps of V47/S48 single and double mutants of AMY1. Parameters of the calculations were set up to get correlation between the calculated and the experimental binding energies of enzymes of a training set. Calculations on an independent test set also resulted in good correlation, except mutants containing neutral to charged residue substitution. Developed method was adopted for several α-amylases and is useful to calculate subsite binding energies of homologous models of wild-type and mutant enzymes by molecular mechanical program using Sybyl molecular modeling software as well as the primary experimental data (BCFs) with the use of computer program SUMA. Our computer-aided procedure may help to understand structure-function relationship of α-amylases and to design enzymes with new features.
Korlátozottan hozzáférhető
The Glucocorticoid Dexamethasone Programs Human Dendritic Cells for Enhanced Phagocytosis of Apoptotic Neutrophils and Inflammatory Response
(2011) Hodrea, Judit; Fésüs, László; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; DE--OEC--Általános Orvostudományi Kar --
The glucocorticoid dexamethasone programs human dendritic cells for enhanced phagocytosis of apoptotic neutrophils and inflammatory response Judit Hodrea, University of Debrecen, Department of Biochemistry and Molecular Biology Doctoral School of Molecular Cell and Immune Biology Supervisor: Prof. Dr. László Fésüs, M.D., M.H.A.Sc. Summary Clearance of apoptotic cells is crucial in maintaining tissue homeostasis. It is performed mainly by professional phagocytes including dendritic cells, the key-players of the immune system. In our work we investigated the role of glucocorticoid dexamethasone on the functions of monocyte-derived human dendritic cells. Dexamethasone increased the phagocytosis of apoptotic neutrophils by immature dendritic cells. DCs develop their capacity to engulf apoptotic cells by up-regulating a set of apopto-phagocytic genes. This gene expression pattern was reprogrammed when differentiation took place in the presence of the synthetic glucocorticoid dexamethasone, which increased the expression of phagocytosis receptors MERTK and CD14, the bridging molecule C1QA, DNASE2 and the adenosine A3 receptor (ADORA3). The increased phagocytosis was attenuated by the addition of ADORA3 antagonist and could not be observed when bone marrow derived dendritic cells of ADORA3 knockout mice were treated with Dex. Although MERTK is up-regulated at cell surface level as well, specific antibodies could not inhibit or block the Dex induced increase of apoptotic cell uptake. We could detect release of the inflammatory cytokine TNFα in the supernatants of Dex treated human dendritic cells, loaded with allogeneic apoptotic neutrophils, and stimulated with LPS and IFNγ. Furthermore, upon Dex treatment iDCs could activate autologous T lymphocytes toward Th1 effector cells and this was enhanced by their exposure to allogeneic apoptotic neutrophils. Several apopto-phagocytosis genes were down-regulated by the glucocorticoid in iDCs, among them TGM2, which was showed previously to be essential in apoptotic cell uptake. TGM2 is also the major auto-antigen in celiac disease, and it has been suggested that its expression on the surface of APC, can be involved in gluten uptake and in the appearance of auto-antibodies. We showed that monocyte-derived iDCs express large amount of TGM2, and this could be detected on the cell surface. We also showed that the cell surface TGM2 is catalytically active and upon LPS stimulation the surface expression level increased, supporting the hypothesis that an unspecific inflammatory process in the gut may expose more transglutaminase activity. The fact that TGM2 is down-regulated by the glucocorticoid treatment while the phagocytic capacity is increased during the differentiation shows that alternative pathways up-regulated by Dex can replace the apopto-phagocytic action of TGM2. Összefoglalás A szöveti homeosztázis fenntartásában jelentős szerepet játszik a természetes sejthalállal elpusztult sejtek folyamatos eltakarítása. Ebben a folyamatban jelentős szerepet vállalnak a professzionális fagocita sejtek, a dendritikus sejtek, amelyek egyben az immunválasz fő szabályozói is, azon képességük révén, hogy kiválthatnak mind aktivációt mind toleranciát. A dexametazon a gyógyászatban igen gyakran használt glükokortikoid, amely az immunrendszer minden sejtjét befolyásolja. In vitro körülmények között, monocita eredetű dendritikus sejtek fagocitáló képességére kifejtett hatását vizsgálva, azt tapasztaltuk, hogy jelentősen megnövelte az allogén apoptotikus neutrofil felvételt. Az apopto-fagocita génekre való hatása pedig ezek kifejeződésének megváltoztatásában nyilvánult meg. Olyan gének expressziója nőtt meg a dexametazon jelenlétében, mint a fagocitózis receptor MERTK és CD14, hídmolekulák közül a C1QA, DNASE2 és ADORA3. Amennyiben a sejteket ADORA3 antagonistával előkezeltük, a dendritikus sejtek fagocitáló képessége lecsökkent. Valamint a génhiányos egerekből differenciáltatott dendritikus sejtek, nem növelik meg fagocitózis képességüket a glükokortikoid kezelés hatására. A MERTK szerepének tisztázására, megvizsgáltuk fehérje szinten a sejtfelszíni expressziót. Noha detektálható a felszínen a fehérje és a glükokortikoid hatásra megnő a felszíni expressziója, specifikus antitestek nem gátolták a fagocitózis Dex indukálta megnövekedését. Dexametazon hatására, apotótikus allogén neutrofil bekebelezése valamint LPS és IFNγ stimulus után, a dendritikus sejtek, TNFα gyulladási citokint termelnek. A megkezelt sejtek képesek T sejt aktiválásra, amit az apoptotikus neutrofilek fagocitózisa képes tovább fokozni. Az apopto-fagocita gének közül, a TGM2 expresszója csökkent. Egér makrofágokon kimutatták, hogy ez az enzim szükséges az apotótikus sejtek fagocitózisához. Feltételezés szerint humán rendszerben, lisztérzékeny betegek estén, a fő antigén prezentáló sejtek (dendritikus sejtek) felszínén lévő transzglutamináznak szerepe lehet a gliadin deamidálásában és a glutén-reaktív T-sejtek fokozott aktiválódásában. Azonban nem ismert olyan adat, amely a humán antigén prezentáló sejtek felszíni TGM2 expresszióját alátámasztaná, valamint a deamidálás pontos helye sem ismert. Eredményeink azt mutatják, hogy a humán monocita eredetű dendritikus sejtek kifejezik a sejtfelszínen ezt a fehérjét és az aktív. Valamint LPS-el való stimulálás esetén a felszíni expresszió megnő. A tény, hogy a glükokortikoid hatásra a TGM2 kifejeződése mind gén, mind fehérje szinten lecsökken, miközben a sejtek fagocitáló képessége megnő, arra utal, hogy Dex hatására alternatív útvonalak aktiválódnak, amelyek helyettesíthetik a transzglutamináz apoptotikus sejtfelvételben játszó szerepét.
Korlátozottan hozzáférhető
Structural analysis and clinical significance of celiac disease antibody epitopes on transglutaminase 2
(2011) Simon-Vecsei, Zsófia; Korponay-Szabó, Ilma; Vecsei, Zsófia; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; DE--OEC--Általános Orvostudományi Kar --
Celiac disease is a pathologic immune reaction to ingested gluten and it is characterized by gliadin-specific T lymphocytes and the production of disease-specific autoantibodies against the enzyme type-2 transglutaminase (TG2). In our work we identified the main celiac epitope of TG2, which is conformational and located at the surface of the enzyme where amino acids from three domains of TG2 are close to each other. The epitope is related to one of the Ca2+ -binding site of the enzyme, but the Ca2+ itself is not involved in the composition of the epitope and in the binding of celiac serum antibodies. Core domain Glu153 and N-terminal domain Arg19 determine the celiac epitope which is accessible both in the closed and open conformation of the protein. Met659 on the C-terminal domain and Glu154 can cooperate in antibody binding. The epitope is relevant and accessible also under tissue conditions when TG2 in bound to fibronectin and was crucial also for coeliac antibodies isolated from tissues or passively transferred to newborns from celiac mothers. Using patient-derived monoclonal single chain antibody fragments we proved in competition experiments that the identified amino acids form one common main epitope. Serum samples from patients with other autoimmune diseases (systemic lupus erythematosus, Sjögren’s syndrome, rheumatoid arthritis) contained anti-TG2 antibodies for which this epitope was not important and showed a clearly different binding pattern to mutants with altered celiac epitope. This indicates that the epitope characterized in this study is celiac disease specific. Our findings also show that the main epitope of TG2 is an antigen already in the early (latent) stage of the disease. Monoclonal mouse antibodies with partially overlapping epitope specificity released celiac antibodies from patient tissues but did not alter the enzymatic activity of TG2 and did not cause similar harmful biological effects in cell culture experiments as celiac antibodies. Such antibodies might have a therapeutic potential. We found that there is a possible structural homology between deamidated gliadin peptides (DGP) and TG2; moreover, non-celiac monoclonal TG2-specific antibodies can recognize DGP. However, according to competition studies celiac IgA also contain additional antibody clones to DGP epitopes that are different from TG2. Identification of the binding site celiac antibodies allows the development of even more specific diagnostic tests and interference with celiac antibody binding might offer some additional therapeutic benefit. The three dimensional homology of DGP and TG2 suggests that molecular mimicry can be an important factor in celiac disease pathogenesis. A coeliakia a vékonybél leggyakoribb krónikus autoimmun betegsége, amely a klinikailag fogékony egyénekben változatos módon manifesztálódhat. A betegség folyamán autoantitestek termelődnek a transzglutamináz 2 (TG2) enzim ellen. Munkánk során azonosítottuk a TG2 fő coeliákiás epitópját, amely konformációs, és az enzim három különböző doménjén, térben egymáshoz közel elhelyezkedő felszíni aminosavai alkotják. Az epitóp kapcsolatban áll az enzim Ca2+-kötő helyeivel, de maga a Ca2+ ion nem része az epitópnak. A core doménen található Glu153 és az N-terminális doménen elhelyezkedő Arg19 határozzák meg kötőhelyet, amely az enzim “csukott” és “nyitott” konformációjában is elérhető az antitestek számára. Az C-terminális doménen lokalizálódó Met659 és Glu154 szintén részt vehet az antitest-kötésben. Az epitóp fontosnak bizonyult attól függetlenül, milyen környezetben jön létre az antigén-antitest kötődés: az enzim szilárd fázishoz kötött, liquid fázisban található vagy fibronektinhez kapcsolt. Az általunk vizsgált szérum eredetű poliklonális, vékonybél biopsziából klónozott monoklonális, szövetekhez kötött és anyából magzatba átjutó coeliákiás antitestek esetében is ez az epitóp volt meghatározó. A betegekből klónozott egyláncú variábilis antitest fragmentek kompetíciós vizsgálatával igazoltuk, hogy a fenti aminosavak egy közös epitópot alkotnak. Különböző más autoimmun betegségekben (szisztémás lupus erythematosus, Sjögren szindróma, rheumatoid arthritis) szenvedő nem coeliákiás betegek antitestei eltérő kötődési mintázatot mutattak a megváltoztatott kötőhelyű mutáns enzimekhez, mint a coeliákiás antitestek, amely arra enged következtetni, hogy az epitóp betegség-specifikus. Ezen kívül bizonyítottuk, hogy ugyanerre az epitópra kötődnek a betegség kezdetekor a látens fázisban lévő betegek antitestei is. Az epitóp egyik részéhez kötődő TG2-specifikus egér monoklonális antitestek képesek leszorítani a szövetekben megkötődött coeliákiás antitesteket in vitro körülmények között, ugyanakkor a TG2 transzamidáló aktivitását nem befolyásolják. Sejtkultúrákban végzett vizsgálatok alapján az is elmondható, hogy ezen monoklonális antitesteknek nincs a coeliákiás antitestekhez hasonló káros hatása, így ezen antitestek, mint specifikus kompetitorok terápiás alkalmazása is felmerül. Vizsgálataink során lehetséges szerkezeti homológiát találtunk a TG2 enzim és a deamidált gliadin peptidek (DGP) között, valamint TG2-specifikus monoklonális antitestek képesek a DGP felismerésére is. Azonban kompetíciós mérések alapján megállapítható, hogy a coeliákiás antitestek a TG2-től eltérő DGP epitópokat is felismernek.
Korlátozottan hozzáférhető
Differentially Expressed Micrornas and the Antiproliferative Role of Mir-126 in Small Cell Lung Cancer
(2011) Miko, Edit; Scholtz, Beáta; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola
MicroRNAs (miRNAs) are small, non-coding RNAs that regulate gene expression by binding to the 3' untranslated region (3'UTR) of target mRNAs, inducing mRNA degradation or translation repression. Approximately 50% of miRNA genes are in cancer-associated genomic regions, suggesting that miRNAs play a significant role in tumor biology. Small cell lung cancer (SCLC) is a high-grade neuroendocrine tumor characterized by rapid progression and frequent metastasis. We combined microarray and qRT-PCR analyses to identify miRNAs aberrantly expressed in SCLC. The microarray approach alone identified 19 miRNAs that are significantly overexpressed and 35 miRNAs that are downregulated in SCLC cell lines compared to normal lung. RNA samples from SCLC cell lines and a small number of microdissected primary SCLC tumors were analyzed with qRT-PCR as well. At first we identified 16 overexpressed and 8 downregulated miRNAs in primary SCLC tumor samples, as well as in SCLC cell line samples. 7 downregulated and 8 overexpressed miRNAs were selected for further analysis in a larger panel of individual SCLC tumors and SCLC cell lines. qRT-PCR analysis verified that miR-126 is a uniformly downregulated miRNA, while miR-301 and miR-183 are uniformly overexpressed miRNAs in all SCLC sample types. We analyzed DNA copy number changes in primary SCLC tumors for 5 genomic regions with overexpressed miRNAs. We identified one novel amplified region in SCLC: 7q32.2 contains the miR-183/96/182 cluster. In our further work we demonstrated that miR-126 overexpression has a negative effect on SCLC cell proliferation, by delaying cells in the G1 phase of the cell cycle. Importantly, we identified SLC7A5 as a novel target of miR-126 in SCLC cells. miR-126 downregulates the expression of SLC7A5 at the translation level, and reduces mRNA stability simultaneously. We demonstrated that in SCLC cells, similarly to other tumor types, suppression of SLC7A5 expression has an anti-proliferative effect. SCL7A5 suppression or miR-126 overexpression both delay SCLC cells in the G1 phase, suggesting that the effect of miR-126 on the cell cycle is mediated at least in part through SLC7A5. SLC7A5 provides the essential amino acids that act as signal to enhance growth of cancer cells through mammalian target-of-rapamycin (mTOR)-stimulated translation. Through different targets, miR-126 can negatively regulate PI3K/Akt pathway, which is aberrantly active in a large percentage of SCLC tumors. Therefore, miR-126 is an important negative regulator of the growth and proliferation of SCLC cells, which probably fine-tunes the activity of the PI3K/Akt/mTOR network through multiple targets, including SLC7A5. A mikroRNS-ek (miRNS) rövid, nemkódoló RNS molekulák, melyek a génexpresszió szabályozásában vesznek részt azáltal, hogy a target mRNS-hez kapcsolódva gátolják azok transzlációját, illetve bizonyos esetekben az mRNS degradációját váltják ki. A tumorbiológiában betöltött szerepüket alátámasztja az a tény is, hogy az ismert miRNS-ek 50%-a olyan genomi régiókban található, melyek tumorokban amplifikálódnak vagy deletálódnak. Az általunk vizsgált tumorttípus a kissejtes tüdőrák (SCLC), ami egy neuroendokrin eredetű, gyorsan metasztatizáló tumor. Kísérleteinkben microarray és qRT-PCR technikák kombinálásával sikerült meghatározni az SCLC-re jellemző miRNS-ek expressziós mintázatát. MiRNS microarray technikával azonosítottunk 19 magas- és 35 alacsony expressziós szintet mutató miRNS-et az SCLC sejtvonalakban a normál tüdőszövethez viszonyítva. A microarray adatoknak megfelelően qRT-PCR technikával sikerült azonosítani 16 magas- és 8 alacsony expressziós szintet mutató miRNS-t az SCLC sejtvonalakban és primer SCLC tumorokban. A továbbiakban nagyszámú primer SCLC tumorban vizsgáltuk a különbözően expresszálódó miRNS-eket. A qRT-PCR egyöntetűen igazolta a miR-126 alacsony, míg a miR-301 és a miR-183 magas expresszióját az összes SCLC mintában, sejtvonalakban és primer tumorokban egyaránt. Kísérleteinkben 5 magas expressziós szintet mutató miRNS kópiaszám változását is megvizsgáltuk és azonosítottunk egy új, SCLC-ben amplifikálódó régiót, a 7q32.2-t, mely tartalmazza a miR-183/96/182 klasztert. További kísérleteinkben az alacsony szinten expresszálódó miR-126 miRNS szerepét vizsgáltuk SCLC sejtekben. Kimutattuk, hogy a miR-126 az SCLC sejtek proliferációját gátolja, a sejtciklus G1 fázisból S fázisba való átmenetét lassítva. Azonosítottunk egy új miR-126 célgént a kissejtes tüdőrákban, az SLC7A5 proteint. Az SCLC sejtekben, más tumorokhoz hasonlóan, az SLC7A5 expressziójának gátlása anti-proliferatív hatással bírt. Mind az SLC7A5 expressziójának gátlása, mind a miR-126 expressziójának növelése késleltette az SCLC sejtek kilépését a sejtciklus G1 fázisából, azt mutatva, hogy a miR-126 sejtciklusra kifejtett hatása részben az SLC7A5 fehérje expressziójának gátlásán keresztül megy végbe. Az SLC7A5 aminosav transzporter gondoskodik az esszenciális aminosavak felvételéről, melyek az mTOR szignál útvonal aktiválásán keresztül szignál molekulaként szolgálnak a tumor sejtek proliferációjához. A miR-126 több fehérjén keresztül vesz részt a PI3K/Akt útvonal szabályozásában, mely az SCLC tumorok nagy részében aberránsan aktív. A miR-126 az SCLC sejtek növekedésének egy fontos negatív regulátora, részben a PI3K/Akt/mTOR szignál útvonalra gyakorolt hatása révén, melyet olyan target géneken keresztül fejthet ki, mint az SLC7A5.
Korlátozottan hozzáférhető
Genomic and Genetic Analysis of Chronic Obstructive Pulmonary Disease and Inflammatory Bowel Diseases
(2011) Póliska, Szilárd; Nagy, László; Póliska, Szilárd; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola
We used genomic and genetic analyses to characterize chronic inflammatory diseases. Gene expression analysis was performed to define gene sets showing differential expression patterns between healthy controls and patients with COPD. Gene expression patterns of AMs and peripheral MOs were examined and COPD-specific overlapping signatures of expression profiles of peripheral blood MOs and AMs were identified demonstrating that peripheral MOs are also affected by COPD. The discriminating power of the set of 23 genes validated in AM samples; and the set of 5 genes validated in MO samples were also demonstrated by using CVA that could separate COPD and healthy patients in both cases in which the χ2 test of canonical correlation was significant at p=0.05. Some of the validated expression changes correlated with lung function parameter, FEV1%. The presented data can provide a basis for more mechanistic studies of disease pathomechanisms and some of the differentially expressed genes might serve as biomarkers of disease progression and effectiveness of therapy. We performed the first genetic association study of Hungarian patients with COPD. Although we could not found any associations with COPD in the case of SERPINE2, TNF-α and SFTPB but our study provided support for the suggested causative role of EPHX1 polymorphisms and phenotypes imputed from exon 3 and exon 4 genotype data in COPD outcome in a Hungarian population. The first investigation of PPARγ gene polymorphisms was carried out in a COPD case-control study and characterized the association of individual SNPs and haplotypes of PPARγ with COPD. The GC haplotype variant showed a modest protective effect.. In addition we have investigated four polymorphisms of PPARγ in a well-characterized Hungarian IBD cohort. We found association between IBD and PPARγ (Pro12Ala) at single loci level suggesting a potential protective effect of the minor Ala allele in CD and we also found haplotypes, which have significantly different frequencies between CD/UC patients and controls. However we could not replicate previous results, where the minor alleles of the two non-coding polymorphisms in intron 1 (rs2067819 and rs3892175) have been found to have significantly higher frequencies in CD cases than in controls. Nonetheless these data provide further support for the notion that a nuclear hormone receptor is linked to human chronic inflammations and warrant further studies on the exact mechanism contributing to disease progression and also as a potential therapeutic target. Munkánk során krónikus gyulladásos betegségeket vizsgáltunk genomikai és genetikai módszerekkel. Alveoláris makrofágok és perifériás monociták génexpressziós mintázatát vizsgáltuk COPD-s és egészséges kontroll mintákon. Mindkét sejttípusban azonosítottunk COPD-specifikus géneket, amelyek között átfedést találtunk. Eredményünk azt suggalj, hogy a betegség érinti az alveoláris makrofág és a progenitor perifériás monocita funkciót. CVA alapján az RT-QPCR-ral validált géncsoportok szignifikánsan elkülönítik a beteg és egészséges pácienseket, továbbá azonosítottunk génexpressziós mintázatokat, amelyek korrelációt mutatnak a FEV1 légzésfunkció paraméterrel. Eredményeink alapul szolgálhatnak további, a betegség pathomechanizmusát vizsgáló mechanisztikus tanulmányoknak, illetve az azonosított gének, a betegség progresszióját jelző biomarkerek, vagy potenciális terápiás célpontok lehetnek. Elvégeztük az első magyar genetikai asszociációs vizsgálatot COPD-s betegeken. A kohorszunk validálásaként egy replikatív vizsgálatban öt COPD-asszociált SNP-t genotipizáltunk, amelyeket korábban már vizsgáltak kaukázusi populációban. A SERPINE2, TNF-α és SFTPB gének polimorfizmusai nem asszociálódtak a COPD-vel vizsgálatunkban, az EPHX1 prediktált fenotípusait vizsgálva az ismert irodalmi eredményekkel azonos eredményt kaptunk. A továbbiakban egy új kandidáns gén a PPARγ gén polimorfizmusainak asszociációját vizsgáltuk a COPD-vel kapcsolatban. A haplotípus analízisben a GC haplotípus enyhe védőhatású volt, ez az eredmény azt suggalja, hogy a PPARγ gén fontos lehet a COPD patogenezisében, valamint potenciális terápiás célpont lehet. A PPARγ polimorfizmusait egy másik krónikus gyulladásos betegségben is megvizsgáltuk, egy jól jellemzett magyar IBD kohorszon. A Pro12Ala ritka Ala alléja védő hatást mutatott a CD kialakulásával szemben az egy lókuszos elemzésben, ezt az eredményt a haplotípus analízis tovább erősítette. Azonban nem sikerült megismételni a korábban más kaukázusi populációkon elvégzett vizsgálatok eredményét az rs2067819 és rs3892175 SNP-k esetében, amelyeknél a ritka allélok jelentősen magasabb gyakoriságot mutattak a CD csoportban a kontrollhoz épest. Ennek ellenére eredményeink tovább erősítik a PPARγ szerepét a bél gyulladásos folyamataiban, és alapot képeznek további mechanisztikus és klinikai hatástanulmány vizsgálatokhoz.
Korlátozottan hozzáférhető
Lycopene Induces Retinoic Acid Receptor Transcriptional Activation in Mice
(2012) Aydemir, Gamze; Rühl, Ralph; Aydemir, Gamze; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; DE--OEC--Általános Orvostudományi Kar -- DE--OEC--Általános Orvostudományi Kar --; DE--OEC--Általános Orvostudományi Kar -- DE--ATC--Mezőgazdaság- Élelmiszertudományi és Környezetgazdálkodási Kar --; DE--ATC--Mezőgazdaság- Élelmiszertudományi és Környezetgazdálkodási Kar -- DE--OEC--Általános Orvostudományi Kar --; DE--ATC--Mezőgazdaság- Élelmiszertudományi és Környezetgazdálkodási Kar --
Lycopene is an acyclic carotenoid containing eleven conjugated double bonds and lacks the β-ionine ring structure present typically in pro-vA carotenoids, therefore it is suggested to be non pro-vA carotenoid. Lycopene is a lipophilic carotenoid which is responsible for the red color of various fruits and vegetables and is commonly found in tomatoes, watermelon, pink-grapefruit and papaya. Emerging health benefits of lycopene have attracted accumulating attention to this carotenoid. Evidence is increasing that tomatoes / tomato preparations are able to ameliorate diseases with a chronic inflammatory background like cancer incidence for certain cancer types of the prostate, breast, colon, esophagus, stomach, rectum, oral cavity and pharynx. The mechanism of action of these beneficial effects induced by lycopene / tomato preparations remains still unknown, but it is suggested that nuclear hormone receptor mediated pathway activation via lycopene-breakdown products might be responsible. The aim of this study was to investigate the potential of lycopene, lycopene-metabolite or tomato extract versus control treatments for the induction of the retinoic acid receptor (RAR) in male mice using a transgenic retinoic acid response-element (RARE)-reporter mouse system. The investigation included whole body scanning of the mice as well as organ specific studies with bio-imaging, selected luciferase activity and qRT-PCR of retinoid target genes and proteins involved in carotenoid-metabolism. Lycopene-treatments induced RARE-mediated cell signaling indicated by quantified bio-imaging, increased luciferase activity. Lycopene supplementations caused the up-regulation of RARE-response in l. intestine, lung, WAT, liver and spleen using the bioimaging and this RARE-LUC activity could be confirmed with luciferase protein assays. The up-regulation of retinoid target gene activation within selected various organs of the mice was observed. Additional experiments focused on RARE-activation in female mice, tomato extract, apo-10-lycac, apo-14-lycac induced RARE-signaling in male mice, treatments displayed comparable RARE-activation like lycopene. In summary, we observed that lycopene, lycopene metabolites and tomato extract have the ability to strongly up-regulate RAR-mediated transcriptional activation pathways in the RARE-LUC reporter mice. However, the responsible biologically active potential lycopene metabolites in the organs are still non-identified.
Korlátozottan hozzáférhető
Pattern Recognition and Innate Immune Signaling in Human Dendritic Cells
(2012) Szabó, Attila; Rajnavölgyi, Éva; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; DE--OEC--Általános Orvostudományi Kar --
Innate immunity represents the phylogenetically earliest host defense mechanism against invading microbes and endogenous harmful materials. Its function involves the recognition of self- and non-self, innocuous and harmful, the initiation of defensive signaling processes, and the coordinated mobilization of effector cells. Dendritic cells (DCs) are major participants in innate immune responses, acting as "sentinels" and ensuring the well-regulated immune surveillance and properly controlled response processes in multicellular organisms. Professional antigen-persenting cells (APCs), such as monocytes, macrophages, and DCs, play important roles in the regulation and coordination of defense mechanisms. In our work we investigated the role of Toll-like receptors and RIG-I-like receptors (TLRs and RLRs) in the regulation of inflammation and type I interferon (IFN) responses of human DC populations. We also studied the role of the two-component adjuvant IC31® in human leukocytes and monocyte-derived DCs (moDCs).We found, that: - the TLR4-mediated, LPS induced IRAK-1 downregulation by itself can induce persistent moDC inactivation; - studying cellular functions in line with activation induced negative feedback mechanisms we showed that early activation of developing moDCs via TLR4 receptor allows transient cytokine production only, followed by the downregulation of effector functions and the preservation of a tissue resident non-migratory phenotype; - our results also revealed that the expression of RLR genes and proteins, as well as the activity of the coupled signaling pathways are significantly higher in the CD1a+ moDC subset than in its phenotypically and functionally distinct counterpart; - the requirement of RLR-mediated signaling in CD1a+ moDCs for priming naïve CD8+ T lymphocytes was confirmed by RIG-I/MDA5 silencing that abrogated these functions; - our results demonstrate the DC subset-specific activation of RLRs, the underlying mechanisms behind the cytokine secretion profiles of the responding cells, and identify CD1a+ moDCs as an inflammatory and migratory DC subset with specialized functional activities; - we also provide evidence that migratory CD1a+ DCs are found in human tonsil and reactive lymph nodes; - we showed that the vaccine compound IC31® is accumulated in blood-circulating monocytes, MHC class II-positive cells, and moDCs; - in the presence of IC31®, the generation of inflammatory CD1a+ moDCs and the secretion of inflammatory cytokines is inhibited, but the production of IFNβ increases; - IC31® was identified as a DC-modulatory adjuvant that sets the balance of NF-κB- and IRF3-mediated signaling pathways to the production of IFNβ; - the adjuvant activity of IC31® on the IFN response was shown to be exerted through TLRs residing in the vesicular compartment of moDCs. Our findings draw the attention to the importance of the functional collaboration of cytoplasmic and membrane-bound pattern recognition receptors. The practical significance of this lies in the targeted modification possibilities of the functions of DC subtypes, and the controlled regulation of cellular immune responses representing crucial options in the practical use of DCs for prophylactic and therapeutic purposes. A veleszületett immunitás a behatoló kórokozókkal és a szervezetben képződő káros anyagokkal szembeni védelem filogenetikailag legősibb formája. Működését az idegen és saját, valamint az ártalmatlan és veszélyes molekulák felismerése, a védelmi reakciót kiváltó jeltovábbítás és a végrehajtó sejtek összehangolt mozgósítása biztosítja. A veleszületett immunitás fontos résztvevői az ezeket a feladatokat ellátni képes dendritikus sejtek (DS), melyek folyamatos “őrszemként” működve biztosítják a többsejtű szervezetek immunológiai felügyeletét és a megfelelően szabályozott válaszfolyamatok elindítását. A hivatásos antigen bemutató sejtek (APS), köztük a monociták, makrofágok és DS-ek kiemelt szerepet játszanak a védelmi mechanizmusok szabályozásában és koordinálásában. Munkánk során a DS-ek által kifejezett Toll-szerű és a RIG-szerű mintázatfelismerő receptorok (TLR és RLR) szerepét tanulmányoztuk emberi DS populációk gyulladásos és I. típusú interferon válaszának szabályozásában. Az két komponensű IC31® adjuváns szerepét emberi fehérvérsejtekben és monocita eredetű DS-ekben tanulmányoztuk. Kimutattuk, hogy - a TLR4-közvetítette, LPS által kiváltott IRAK1 kifejeződés csökkenése önmagában elegendő a moDS-ek funkcióinak tartós gátlásához; - a sejtaktiváció által kiváltott negatív visszacsatolási mechanizmusokat elemezve kimutattuk, hogy csak a fejlődő és még nem véglegesen differenciált moDS-ek esetében a korai TLR4 receptoron keressztüli aktiválás a gyulladáskeltő citokinek átmeneti és korlátozott megjelenését váltja ki, ami a végrehajtó funkciók szabályozott csökkenéséhez vezet, és a szövetközi vándorlásra nem képes állapot megőrzése követ; - eredményeink szerint az RLR gének és fehérjék, valamint a kapcsolódó jelátviteli útvonalak elemeinek kifejeződése szignifikánsan magasabb a CD1a+ DS-ekben, mint a fenotípusos tulajdonságaik és funkcionális aktivitásuk alapján is különböző CD1a- altípusban; - a RIG-I és MDA5 gének csendesítésével végzett kísérleteink az RLR-ok által közvetített jelátvitel fontosságát igazolták a CD1a+ DS-ek általi naïve CD8+ T-sejtek aktiválásában; - kísérleti eredményeink az RLR rendszer DS altípus-specifikus működését igazolták, és feltárták az ennek hátterében álló molekuláris mechanizmusokat, a CD1a+ DS-eket egyedi funkciókkal rendelkező, gyulladásos sejttípusként azonosítottuk; - azt is bebizonyítottuk, hogy a vándorló képességgel rendelkező CD1a+ DS-ek emberi nyirokszövetekben is kimutathatóak; - a két komponensű IC31® adjuváns a vérben keringő monocitákban, MHC-II+ sejtekben és moDS-ekben halmozódik fel; - az IC31® jelenlétében differenciálódó DS-ekben gátolt a CD1a+ sejttípus differenciációja, a gyulladásos citokinek szekréciója, miközben a sejtek IFNβ termelése fokozódik; - az IC31® adjuvánst olyan – a DS-ek funkcionális sajátságait módosító –oltóanyag komponensként azonosítottuk, amely az NF-κB és IRF3 jelátviteli útvonalak egyensúlyának befolyásolásával révén moDS-eben fokozza az IFNβ citokin termelését, miközben az NF-kB jelpálya és a gyulladáskeltő citokinek megjelenése gátolt; - azt is igazoltuk, hogy az IFNβ termelést fokozó aktivitás a moDS-ek sejten belüli vezikuláris rendszerében halmozódó TLR-okon keresztül valósul meg. Kutatási eredményeink a membránhoz kötött és a citoplazmában elhelyezkedő mintázatfelismerő receptorok közti funkcionális munkamegosztás jelentőségére hívják fel a figyelmet. Ennek gyakorlati jelentőségét a DS altípusok funkcióinak célzott módosítási lehetőségei és a sejtes immunválasz irányított szabályozása jelenti, aminek nagy jelentősége van a DS-ek megelőző és terápiás célú gyakorlati felhasználásában.
Szabadon hozzáférhető
Borderline methicillin-rezisztens Staphylococcus aureus törzsek ß-laktamázainak analízise
(2012) Keserű, Judit Szilvia; Biró, Sándor; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; DE--OEC--Általános Orvostudományi Kar -- Humángenetikai Tanszék; DE--ATC--Mezőgazdaság- Élelmiszertudományi és Környezetgazdálkodási Kar --
A Staphylococcus aureus az egyik legjelentősebb patogén baktérium, ezért a törzsek antibiotikum-rezisztenciájának vizsgálata nagy fontossággal bír. Massidda és munkatársai leírtak egy olyan enzimet borderline methicillin-rezisztens S. aureus-ban (BORSA), mely képes volt bontani az oxacillint. Ez a 31 kDa-os enzim methicillin indukció hatására jelent meg a membránfrakcióban, és nem lehetett átvinni Escherichia coli-ba a BlaZ penicillináz génjét hordozó plazmid transzformálásával. A célunk az volt, hogy ezt az oxacillinázt azonosítsuk. Különböző forrásból származó S. aureus-ok közül oxacillin MIC értékek alapján kiválasztottuk a BORSA törzseket, összesen 7 humán és 4 bovin izolátumot. A 4 bovin és 6 humán izolátum mecA negatív volt, de a 822-es törzs hordozta a mecA-t, esetében a PBP2a nem működhetett megfelelően. Irodalmi adatok szerint a BORSA törzsek mind az V. fágtípusba tartoznak, és csak az ilyen fágokkal tipizálható MSSA (methicillin-érzékeny S. aureus) törzsek váltak borderline rezisztenssé, és mutattak oxacillin-bontó képességet a blaZ-t hordozó plazmid transzformálása után. Törzseink esetében az összes humán és három bovin izolátum tipizálódott az V. fágcsoport fágjaival, kivéve a nem tipizálható 822-es törzset. Ezek közül a bovin izolátumok közül kettő nem volt tipizálható a bovin fágokkal, valószínűleg emberről kerültek át szarvasmarhára. Biológiai titrálással megállapítottuk a törzsek oxacillin-bontó aktivitását, ami 10-3 – 10-4 μmol/mg teljes fehérje/perc közé esett, leggyengébben az V. fágcsoportbeli fágokkal nem tipizálódó bovine törzs teljesített. Minden törzs indukció nélkül is termelt enzimet, melynek mennyisége növelhető volt methicillin jelenlétében való tenyésztéssel. Az extracelluláris és a membránkötött fehérjék 1-D majd 2-D SDS-poliakrilamid gél elektroforézise során a gélben ß-laktamáz aktivitást detektáltunk. A 30 kDa-os és a 14 kDa-os molekulatömeg-tartományban mutattunk ki enzimaktivitást, és a fehérjéket tömegspektometriai analízisnek vetettük alá. A 14 kDa-os tartományban detektált fehérje a sejtek feltárására használt lizozim volt. Spektrofotométerrel meg is tudtuk határozni nitrocefin és cefaloridin bontó aktivitását. A 30 kDa-os tartományban általában több fehérje volt jelen a 2-D géleken, savas (pI 4-5) illetve bázikus (pI 9-10) pH tartományban, melyeket BlaZ-ként azonosítottunk. A két szarvasmarhára adaptálódott törzs esetében szintén a BlaZ volt a ß-laktamáz aktivitás fő forrása, de a referencia szekvenciától egy kb. 7%-ban eltérő variáns. Mivel a fragmentek között olyanokat is találtunk, melyek a referencia szekvenciára illeszkedtek, és az adatbázisban fellelhető variánsra nem, ezért feltételezzük, hogy a törzsek ß-laktamázának szekvenciája még nem szerepel az NCBI adatbázisban. Mivel a Dr. Massidda által rendelkezésünkre bocsátott két BORSA törzsben is csak a BlaZ-t tudtuk azonosítani, ezért a végkövetkeztetésünk az, hogy ezek a törzsek nem egy új oxacillináz enzimmel rendelkeznek, hanem a BlaZ penicillináz rendelkezik megnövekedett oxacillináz aktivitással. Feltételezzük, hogy ezt valamilyen poszttranszlációs módosítás (vagy éppen egy módosítás elmaradása – eltávolítása) okozhatja, mely magyarázhatja az eltérő pI és kissé eltérő molekulatömeg értékeket is. Staphylococcus aureus is one of the most important pathogenic bacterium, so the investigations of the antibiotic-resistance of the strains have crucial importance. Massidda and co-workers described an enzyme in borderline methicillin-resistant S. aureus (BORSA), which was also able to hidrolyse oxacillin. This 31-kDa enzyme was found in the membrane fraction after methicillin induction and it could not be transformed to Escherichia coli using the plasmid carrying the gene of BlaZ penicillinase. The aim of our study was to identify this enzyme. We have selected BORSA strains (altogether 7 human and 4 bovine isolates) from different sources according to their oxacillin MIC values. All 4 bovine and 6 of the human isolates were mecA negative but strain 822 carried mecA. In this latter case the encoded enzyme must have been defective. According to the published data all of the BORSA strains belong to phage type V. and only MSSA (methicillin-sensetive S. aureus) strains typable with group V. phages became borderline resistant and showed oxacillin-hydrolysing ability after the transformation of a blaZ bearing plasmid. We have found that all the human isolates except 822 were typable with group V. phages. Three of the bovine isolates were also typable with group V. phages, but interestingly two of these strains were not typable with the bovine phages, so they might had been transferred from human to cow. The exact oxacillinase activity of the strains was also determined. Oxacillin was hydrolysed at a 10-3 – 10-4 μmol/mg total protein/minute activity. The slowest hydrolyser was the bovine strain, which was not typable with group V. phages. All the strains produced ß-lactamase constitutively and the rate of enzyme production could be increased by culturing the strains in the presence of methicillin. Extracellular and membrane-bound proteins were separated by 1-D and then by 2-D SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and the in situ ß-lactamase activity was detected. We have detected ß-lactamases at the 30 kDa and 14 kDa molecular weight range and the proteins were analysed by mass spectrometry. The protein detected at 14-kDa was identified as lysozyme, which was used in our experiment to hydrolyse bacterial cell wall. Its nitrocephin and cephaloridin hydrolysing ability could be determined by spectrophotometric method. 30-kDa proteins with ß-lactamase activity were detected both in acidic (pI 4 – 5) and basic (pI 9 – 10) pH ranges. These proteins were identical to the BlaZ. In the case of the two bovine specific strains BlaZ was the main source of the ß-lactamase activity, too, however, the identified enzyme was a variant of BlaZ, differing approximately in 7% of its amino acids compared to that of the reference sequence. Since some such fragments were found, which could be fitted to the reference sequence, but not to the identified variant, it was concluded that the sequences of the ß-lactamases present in the two bovine specific strains have not been deposited to the NCBI database yet. Since in the two BORSA strains, kindly provided by Dr. Massidda we detected only BlaZ enzyme, our final conclusion is that these strains do not harbour a new oxacillinase enzyme, but their penicillinases showed elevated oxacillinase activity. The elevated oxacillinase activity could be the consequence of some posttranslational modifications (or the lack of it), which could explain the differences in the pIs and in the molecular weights of the identified ß-lactamase enzymes.

Böngészés

Molekuláris Sejt- és Immunbiológia Doktori Iskola Megjelenés dátuma szerinti böngészés

Találat egy oldalon

Rendezési lehetőségek