Molekuláris Sejt- és Immunbiológia Doktori Iskola

Állandó link (URI) ehhez a gyűjteményhez

https://hdl.handle.net/2437/31600

Általános Orvostudományi Kar

Molekuláris Sejt- és Immunbiológia Doktori Iskola
(vezető: Dr. Balogh István)

Orvostudományi doktori tanács

D183

tudományág:
- elméleti orvostudományok

Böngészés

Molekuláris Sejt- és Immunbiológia Doktori Iskola Szerző szerinti böngészés "Balogh, István"

Megjelenítve 1 - 3 (Összesen 3)
  • Nincs kép
    TételSzabadon hozzáférhető
    Molekuláris epidemiológiai és diagnosztikai vizsgálatok cisztás fibrózisban
    Ivády, Gergely; Balogh, István; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; DE--Általános Orvostudományi Kar -- Laboratóriumi Medicina Intézet
    Az értekezés két fő témára összpontosít: a cisztás fibrózist okozó mutációk típusának és gyakoriságának felmérésére Magyarországon és a betegség korszerű molekuláris genetikai diagnosztikájára. A magyarországi mutációspektrum meghatározása több lépésben, összesen 85 beteg bevonásával történt. A vizsgálatokat kaszkád-rendszerben végeztük, melynek finomítása fokozatosan zajlott. Ennek végső formájában a CF mutációanalízist a következő sorrendben végeztük: Elucigene CF29v2 assay (eltérés esetén az adott exon célzott szekvenálása a c.1521_1523delCTT kivételével) és a CFTRdele2,3(21kb) vizsgálata, az e4, e6, e11, e14, e15 és e20, majd a CFTR további exonjainak szekvenálása, végül MLPA analízis. Az összesített eredmények alapján 169/170 allél került meghatározásra, melyeken 31 féle CF-okozó variánst azonosítottunk. Ezek között két új mutáció is szerepelt, (c.1394C>T és c.1037_1038insA), melyek minden valószínűség szerint kóroki eltéréseknek tekinthetők. A mutációk földrajzi eloszlásában több jellegzetességet is kimutattunk, ezek az irodalomban leírtakkal összhangban vannak. A rendelkezésünkre álló piroszekvenátor tesztelése egy plazmid rendszer segítségével kezdődött. Itt elsősorban a készülék homopolimer detektáló képességeire koncentráltunk. A kísérlet az 5-merek és 6-merek kevésbé megbízható azonosíthatóságát mutatta ki. A vizsgálatok nem támogatták azt az elképzelésünket, hogy a szekvenáló reakció elején a homopolimer detektálás pontosabban zajlana, mint később. Ezután humán minták tesztelése következett, melyek 17 pácienstől származtak. Az eredmények alapján az általunk használt készülék alkalmasnak bizonyult a CF gyanújával érkező betegek vizsgálatára, annyi megkötéssel, hogy egy gyakorinak mondható, mégis nehézkesen detektálható eltérést továbbra is Sanger szekvenálással vagyunk kénytelenek megerősíteni. Végezetül úgy gondoljuk, hogy eredményeink érdemben járulnak hozzá hazánkban a cisztás fibrózis laboratóriumi diagnosztikájához és reményeink szerint segítséget nyújthatnak az újszülöttkori szűrés/heterozigóta-szűrés bevezetésében is.
  • Nincs kép
    TételSzabadon hozzáférhető
    Mutációs spektrum meghatározása monogénes kórképek esetén új generációs szekvenálási módszerek segítségével
    Madar, László; Balogh, István; László; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; Általános Orvostudományi Kar::Laboratóriumi Medicina Intézet::Klinikai Genetikai Tanszék
    A bemutatott tanulmányokban különböző új generációs szekvenálási módszerek alkalmazhatóságát és hatékonyságát vizsgáltuk két monogénes kórképben. Mindkét betegség esetén elmondható, hogy a molekuláris genetikai vizsgálati módszerek az elmúlt 10-15 évben teljes mértékben átalakultak. Korábban az eltérések kimutatását célzó genetikai vizsgálat az ismert variánsok esetében célzott vizsgálatot, például restrikciós emésztést jelentett, addig az ismeretlen, nukleotid szintű eltérések kimutatására a költséges és időigényes Sanger féle DNS szekvenálás jelentette az egyetlen lehetőséget. Olyan nagyméretű gének esetében, mint például a 65 kódoló exonnal rendelkező FBN1 ez rendkívül költséges és időigényes volt, hiszen minden egyes exonra meg kellett tervezni a primereket és külön-külön elvégezni a Sanger szekvenálást. Szintén nehezen kivitelezhető volt ez a megközelítés a genetikai heterogenitással rendelkező kórképek esetén, mint például a familiáris hiperkoleszterinémia, mivel a betegség hátterében nemcsak egy, hanem több gén is állhat. Ezen gének mérete pedig szintén kihívást jelentett. Sokáig itt is a variáns specifikus, vagy egy-egy rövid DNS szakasz célzott vizsgálata jelentette a DNS szintű analízist. Ezeket a problémákat küszöbölte ki egyszerre a molekuláris diagnosztikába berobbanó új generációs szekvenáló technikák megjelenése. Immáron nem volt kizáró ok egy gén mérete, illetve az sem, ha egy adott betegség hátterében több gént is vizsgálnunk kell a kóroki eltérés keresése során. Az első tanulmányban 26 egymással rokoni kapcsolatban nem álló egyén genotípus- fenotípus összefüggéseit írtuk le, akik Marfan szindróma vagy egyéb kötőszöveti betegség iránydiagnózisával érkeztek. A vizsgálat során két különböző új generációs szekvenáló platformot és három DNS könyvtárkészítési módszert használtunk. Összesen 23 betegben azonosítottunk valamilyen kóroki vagy potenciálisan kóroki eltérést az FBN1 génben, melyek közül 16 visszatérő variáns volt, 7 eltérést pedig korábban még nem írtak le. Az általunk kimutatott eltéréseket összevetettük az irodalmi adatokkal. Az esetek nagyrészében az FBN1 variánsok Marfan szindrómával társultak, 2 esetben pedig a szindróma súlyos, korai megjelenésű (neonatális) formájával. Marfan szindróma esetén nagy jelentősége lehet a patogén eltérések azonosításának, mivel rendkívül fontos a várható következmények miatt a pontos genotípus-fenotípus összefüggés felismerése. A patogén variáns ismeretében az irodalmi adatok jó támpontot nyújthatnak abban, hogy a várható szövődményeket megelőzzék, illetve késleltessék. Sok esetben szoros kardiológia, szemészeti és ortopédiai követés ajánlott a betegeknek. A súlyos aortaérintettség miatt szintén fontos szerep jut a genetikai diagnózisnak az esetleges műtéti beavatkozások tekintetében. A második tanulmányban a magyarországi familiáris hiperkoleszterinémiás betegek genetikai hátterét igyekeztünk feltérképezni. Mivel a betegség hátterében több gén patogén eltérése is felmerül ezért a kórképpel kapcsolatba hozható géneket vizsgáló kitet használtunk a minták analízisére. Összesen 44 beteg esetében tudtunk kóroki vagy valószínűleg kóroki eltéréseket kimutatni. Hét beteg az APOB, míg 37 beteg az LDLR génben hordozott valamilyen eltérést. Három beteg esetében összetett heterozigóta genotípus igazolódott, mely magyarázta a súlyosabb klinikai tüneteket. Bemutattuk a betegek főbb klinikai paramétereit és a genotípus-fenotípus összefüggéseit. Két-két LDLR és APOB eltérés detektáltunk, melyek korábban még nem kerültek leírásra. A familiáris hiperkoleszterinémia hátterében álló leírt és nem leírt variánsokat összehasonlítottuk az irodalmi adatokkal. Meghatároztuk továbbá egy 1 exont érintő deléció pontos töréspontjait is. A familiáris hiperkoleszterinémia korai felismerése rendkívül fontos. A betegség még mindig rendkívül aluldiagnosztizált és későn vagy egyáltalán nem kerül felismerésre a végzetes kimenetelű kardiovaszkuláris szövődmények miatt. A korai életkorban (főleg gyerekkorban) felismert FH időben elindított lipidcsökkentő kezelése esetlegesen rendelkezésre álló célzott gyógyszerterápia, valamint a diéta és a szoros követés mind hozzájárulhat ahhoz, hogy a betegek jó életminőségben és kisebb kardiovaszkuláris kockázattal élhessenek. Szintén hangsúlyozni szükséges a genetikai tanácsadás fontosságát, hiszen az érintett családtagok felvilágosítása és szűrése kiemelkedő fontosságú a lehetséges szövődmények miatt.
  • Nincs kép
    TételSzabadon hozzáférhető
    Súlyos monogénes betegségek prenatális és postnatális genetikai diagnosztikai kihívásai
    Koczok, Katalin; Balogh, István; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; DE--Általános Orvostudományi Kar -- Laboratóriumi Medicina Intézet Klinikai Genetikai Tanszék
    A bemutatott tanulmányokban súlyos monogénes betegségek prenatális és postnatális molekuláris genetikai diagnosztikájának néhány speciális kihívást jelentő aspektusát vizsgáltuk. Az első vizsgálatsorozatban három molekuláris genetikai teszt anyai sejt kontaminációra való érzékenységének meghatározását végeztük el. A Sanger DNS szekvenálás esetén a szignifikáns anyai sejt kontamináció szint 5-30%-nak adódott. Az MLPA teszt esetén ≥40% anyai DNS kontamináció interferált a ’magzati’ genotipizálással. A piroszekvenálás igen érzékenynek bizonyult, 1% anyai sejt kontamináció kimutatása is lehetséges volt. A második tanulmányban egy 14 hónapos fiúgyermek Duchenne/Becker-izomdystrophia irányú többszintű genetikai kivizsgálását végeztük el. Az elsővonalbeli tesztként elvégzett MLPA teszt a 4. exon delécióját mutatta, melyet más módszerrel megerősíteni nem tudtunk. A DMD gén teljes kódoló régiójának szekvenálása egy új pontmutáció (c.227A>T, p.Asn76Ile) jelenlétét igazolta, mely a dystrophin fehérje N-terminális aktinkötő doménját érinti. In silico analízisek alapján a mutáció feltehetően destabilizálja az N-terminális aktinkötő domént. A dystrophin fehérje immunhisztokémiai vizsgálata BMD-t valószínűsített. A harmadik tanulmányunkban 13 magyar SLO szindrómás beteg molekuláris genetikai adatait, biokémiai és klinikai jellemzőit foglaltuk össze. Minden esetben jelentősen emelkedett szérum 7-DHC koncentrációt mértünk. A mutáció detektálási ráta 95,8% volt. Magyarországon három allél (p.Trp151*, c.964–1G>C és p.Val326Leu) felelős a betegséget okozó genetikai eltérések 54%-áért. Egy esetben null mutációra homozigóta genotípus, míg a további esetekben összetett heterozigótaság igazolódott. Egy új misszensz mutációt is detektáltunk (c.374A>G, p.Tyr125Cys), melyet valószínűleg patogénként kategorizáltunk.