PhD dolgozatok

Állandó link (URI) ehhez a kategóriához

https://hdl.handle.net/2437/2265

Az archívumban található doktori disszertációkat a Debreceni Egyetem Egyetemi és Nemzeti Könyvtár a

2011. évi CCIV. törvény a nemzeti felsőoktatásról 53. § (5) bekezdés c) pont

2011. évi CCIV. törvény a nemzeti felsőoktatásról 53A. § (1) bekezdés

387/2012. (XII.19.) Korm. a doktori iskolákról, a doktori eljárások rendjéről és a habilitációról 14. § (1) bekezdés

illetve a Debreceni Egyetem doktori szabályzata értelmében hozza nyilvánosságra. A Művek szerzői jogáról a hatályos 1999. évi LXXVI. törvény (Szjt.) és a Debrecen Egyetem szellemi tulajdon kezelési szabályzata rendelkezik.

Böngészés

Megjelenítve 1 - 20 (Összesen 3783)

Szabadon hozzáférhető
Az emlő laphámsejtek etilén-oxid expozícióval szembeni fokozott érzékenysége
(2006-05-26T13:25:38Z) Ádám, Balázs; Ádány, Róza; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Népegészségügyi Iskola -- Megelőző Orvostani Intézet; Egészségtudományok doktori iskola; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum
Az etilén-oxid az egyik legjelentősebb epoxid vegyület, melyet a Nemzetközi Rákkutató Intézet a bizonyítottan humán rákkeltők csoportjába sorolt. Nagy reakciókészsége miatt gyakran használt vegyipari intermedier és sterilizáló szer, képes alkilálni a DNS-t, lúglabilis sérüléseket és száltöréseket hozva létre. Etilén-oxid expozíciónak kitett dolgozók körében a leukémia és limfóma emelkedett előfordulási gyakoriságát figyelték meg; egyéb daganattípusok – például emlőrák – előidézésében betöltött szerepével kapcsolatban azonban ellentmondó eredmények születtek. A vizsgálataink célja különböző szövetekből származó sejtek érzékenységének összehasonlításával, az etilén-oxid szerv specifikus hatásának jellemzése révén, az emlőrák kialakulásában betöltött feltételezett szerepének tanulmányozása volt. Az anyag genotoxikus tulajdonságát üstökös elektroforézis alkalikus változatával vizsgáltuk primer és szekunder sejtkultúrákon a hatos oxidációs számú krómmal végzett hasonló kísérleteinknél kidolgozott in vitro rendszerben. A DNS károsodás jellemzése a csóva DNS tartalmával, csóvahosszal és tail moment értékekkel történt. A természetes célsejteket reprezentáló limfoblasztok etilén-oxid genotoxikus hatásával szembeni érzékenységét vetettük össze a feltételezett célsejtként számon tartott emlő laphámsejtek, a biológiai monitorozás számára könnyen hozzáférhető sejtpopulációt jelentő perifériás limfociták, valamint a célsejtnek nem tekinthető méhnyak laphámsejtek és keratinociták érzékenységével. Az etilén-oxid a DNS károsodás dózisfüggő emelkedését hozta létre a 0–100 µM koncentrációtartományban jelentős sejtelhalás nélkül. A DNS károsodás szintjének statisztikailag szignifikáns emelkedése volt kimutatható 20 µM etilén-oxidos kezelés után limfoblasztokban, emlő laphámsejtekben és perifériás limfocitákban. Keratinocitákban és méhnyak laphámsejtekben szignifikáns emelkedés nem következett be, csak magasabb koncentrációknál (50–100 µM). Az eredmények az emlő laphámsejtek etilén-oxid genotoxikus hatásával szembeni fokozott érzékenységét jelzik. Megfigyeléseink további adatokat szolgáltatnak az etilén-oxid expozíció emlőrák kialakulásában betöltött feltételezett szerepének értékeléséhez, és az eredmények hozzájárulhatnak genotoxikus hatásokra adott korai választ monitorozó munkahelyi vizsgálatok kidolgozásához.
Szabadon hozzáférhető
Humán malignus melanoma progressziójával társuló genetikai eltérések analízise in situ hibridizációs módszerekkel
(2006-12-15T12:31:40Z) Ádám, Zsuzsanna; Balázs, Margit; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Népegészségügyi Iskola -- Megelőző Orvostani Intézet; Egészségtudományok doktori iskola
A betegekből származó melanoma szövetmintákon és sejtvonalakon végzett kísérleteink során alkalmazott CGH és FISH érzékeny és hatékony módszernek bizonyult a melanoma kromoszómális eltéréseinek kimutatásában. Primer melanomán és metasztázisán interfázisos FISH módszerrel bizonyítottuk, hogy a kromoszómális deléciók nemcsak a tumor progresszióban, de a tumor iniciációjában is szerepet játszanak. Megállapítottuk, hogy a genetikai aberrációk fokozatos akkumulációja együtt jár a melanoma agresszivitásának növekedésével. CGH adataink alapján a genetikailag heterogén primer tumor számos sejtpopulációja között a klonális szelekció eredményeként megjelenik a metasztatikus sejtklón. A 7-es kromoszóma többlete a malignus melanomában rossz prognózissal társul, eredményeink szerint aneuploidiája vagy a kromoszómán lokalizálódó gének amplifikációja kapcsolatban állhat a fokozott metasztázisképző potenciállal. Az agresszív, máj-metasztázist képző sejtvonalban a metasztázisképző hajlamhoz társuló genetikai eltérések közül eddig ismeretlen 4-es kromoszóma deléciója újabb fontos, az áttétképzéssel összefüggésbe hozható onko-szuppresszor gének jelenlétére hívhatja fel a figyelmet. Megállapítottuk, hogy a 9-es és 10-es kromoszóma vagy ezeknek a kromoszómáknak bizonyos szakaszai a metasztatikus progresszió korai fázisában deletálódnak és ezek a genetikai eltérések a távoli metasztázisok kialakulásában is szerepet játszanak. A 6p és a 8q szakaszok amplifikációja későbbi eltérések és elsősorban a tumor növekedésében és az invázióban játszanak szerepet, a 7-es kromoszóma aberráció a metasztázis megjelenéséhez, a 4-es kromoszóma elvesztése pedig a távoli máj-metasztázis kialakulásához köthető. Ezeknek a kromoszómáknak az aberrációi így egy progressziós sort képviselnek. Saját és az irodalomban megjelent tanulmányok alapján a 7-es kromoszóma többlet és a 9p és 10q kromoszóma karok vesztése a metasztázis kialakulásához kapcsolódó genetikai markereknek tekinthetők.
Szabadon hozzáférhető
Structural Investigation of Transglutaminases
(2006-12-15T12:47:18Z) Ambrus, Attila; Fésüs, László; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Általános Orvostudományi Kar -- Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet; Elméleti orvostudományok doktori iskola
The structural basis of the Ca2+ effect on transglutaminases is poorly defined. Therefore, it was our intention to initiate 43Ca NMR, surface polarity analysis combined with multiple sequence alignment studies to obtain structural information about the Ca2+ binding properties of the Factor XIIIA2, TGase 2 and TGase 3 (each of human origin). Since Ca2+ is also implicated in the folding of TGase 2, refolding studies were also performed to elucidate the nature of these effects. We have constructed a new homology model of human TGase 2 on the basis of the highest resolution (2.1Ã…) X-ray structure of cellular FXIII zymogen available. Our structure is more accurate than all the previously published homology models of human TGase 2. We have performed surface polarity analysis on the high resolution structure of cellular FXIII zymogen and on our homology model of TGase 2. Results are combined with that of the multiple sequence alignment of TGases and in this manner we could identify probably all the potential Ca2+ binding sites on these molecules; their numbers are more than reported earlier. From the previously published three putative sites of TGase 2, two possess negativity on the surface but the third one does not. Interestingly, in the recently determined high affinity binding pocket of FXIII, only one amino acid shows considerable negative potential on the molecular surface. The potential Ca2+ binding sites of all TGases can be predicted using the results of this analysis. In accordance with the high number of negatively charged clusters in our surface polarity analysis, 43Ca NMR provided higher (but still millimolar) average dissociation constants titrating on a wide Ca2+ concentration scale than previous studies did by equilibrium dialysis in shorter ranges. These results suggest the existence of low affinity Ca2+ binding sites on both FXIII-A and TGase 2 in addition to the well-known high affinity ones. Increasing the salt concentration or activating with thrombin, FXIII-A2 partially lost its original Ca2+ affinity in contrast to previous results, which showed no effects. The NMR data suggests different mechanisms for the proteolytic and salt activation processes of FXIII. The NMR provided structural evidence for the GTP induced conformational changes of TGase 2 molecule diminishing all of its Ca2+ binding sites. The NMR data on the Ca2+ binding properties of the first analyzed TGase 3 are presented here; TGase 3 binds Ca2+ the most tightly which weakens after proteolytic activation. Structural investigation of TGases 42 The investigated TGases have very symmetric Ca2+ binding sites and no EF-hand motifs. The refolding of the recombinant TGase 2 molecule to its catalytically active form from inclusion bodies essentially needs the presence of a helper material with higher molecular mass, but only in the initiation phase. In natural conditions it is probably a chaperon, while in vitro, it could be e.g. PEG. Ca2+ and nucleotides are ascribed as effector molecules in the early phase of the tructural reconstitution of TGase 2; the most efficient condition if they are together in the refolding buffer. Two optimal concentrations of PEG (probably two different folding pathways) and a relatively long time scale (with two activity maxima) for the evolution of the final structure of TGase 2 were identified during its refolding. An optimized refolding procedure of the non-fused recombinant TGase 2 is reported.
Szabadon hozzáférhető
A placenta macrophagok szerepének in vitro vizsgálata a humán cytomegalovírus és a humán immundeficiencia vírus 1. típusa vertikális átvitelében
(2006-12-15T13:01:25Z) Bácsi, Attila; D. Tóth, Ferenc; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Általános Orvostudományi Kar -- Orvosi Mikrobiológiai Intézet; Gyógyszertudományok doktori iskola
Szabadon hozzáférhető
A vestibularis magok kapcsolatainak vizsgálata békában és patkányban
(2006-12-15T13:07:34Z) Bácskai, Tímea; Matesz, Klára; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Általános Orvostudományi Kar -- Anatómiai, Szövet- és Fejlődéstani Intézet; Elméleti orvostudományok doktori iskola
Különböző molekulatömegű festékek alkalmazásával kimutattuk, hogy békában a primer afferens vestibularis rostok dye-coupled kapcsolatban vannak a másodlagos vestibularis neuronokkal, valamint a kisagyi szemcsesejtekkel. Ezek a dye-coupled kapcsolatok gap junctionok jelenlétére utalnak. Pályakövetéses módszerek alkalmazásával feltérképeztük a béka nucleus vestibularis lateralisanak (NVL) antero-, és retrograd kapcsolatrendszereit. Kimutattuk a korábban ismeretlen diencephalikus kapcsolatot, mely reciprok jelleggel bír. Leírtuk a NVL kapcsolatát a különböző mesencephalikus központokkal, így a szemmozgató agyidegi magokkal, és a tegmentális magokkal. Leírtuk a nucleus fasciculus longitudinalis medialist békában. Kimutattuk, hogy vestibularis rendszer kiterjedt kapcsolatban áll a formatio reticularissal, ami alapján feltételezhető, hogy a béka formatio reticularisa fontos szerepet tölt be a vestibularis ingerület közvetítésében. Kimutattuk a vestibularis rendszer és a proprioceptív impulzusokat fogadó agyterületek közötti reciprok kapcsolatot. Megtaláltuk a leszálló rostok által kialakított vestibulospinalis pályákat, amelyek a gerincvelő valamennyi funiculusában követhetőek egészen a lumbalis szegmentumokig, valamint leírtuk a spinovestibularis pálya eredő sejtjeit. Patkány esetében valamennyi vestibularis mag anterograd kapcsolatrendszerét leírtuk központi idegrendszeri struktúrákkal. Ezek közül kiemelendő a NVS korábban nem ismert kapcsolata a gerincvelővel. Leírtuk a vestibularis magok és nucleus ruber korábban ugyancsak ismeretlen kapcsolatát, amely az elektronmikroszkópos vizsgálatok alapján gátlónak és döntően GABAergnek bizonyult. Ennek alapján feltételezhető, hogy a NVS képes módosítani a cortico-rubralis és cerebello-rubralis útvonalak aktivitását a nucleus ruber neuronjainak gátlásával. Az általunk alkalmazott jelölési technikák segítségével lehetővé vált a vestibularis magok és a formatio reticularis kapcsolatainak pontosabb és részletesebb leírása. Kimutattuk a NVL reciprok kapcsolatait a rhombencephalonnal, valamint a gerincvelővel, ami alátámasztja a korábbi élettani vizsgálatok eredményeit. Mivel vizsgálataink az alapkutatások körébe tartoznak közvetlen gyakorlati hasznosításról nem beszélhetünk. A vestibularis rendszer szerkezetének pontos feltérképezése, a meglévő adatok újakkal való kiegészítése hozzájárulhat ahhoz, hogy megismerjük a vestibularis károsodás tüneteinek kialakulásáért és az azt követő kompenzációs folyamatokért felelős történéseket.
Szabadon hozzáférhető
A humán T limfociták Kv1.3 csatornájának farmakológiai és sejtfelszíni topológiai vizsgálata
(2006-12-19T09:56:34Z) Bagdány, Miklós; Panyi, György; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Általános Orvostudományi Kar -- Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet; Elméleti orvostudományok doktori iskola
Knowledge gathered about the voltage-gated K+ channel Kv1.3 in recent years indicates the essential role of this channel in T cell activation and the killing process of cytotoxic cells. It is therefore of utmost importance to understand the details of the physiological role of Kv1.3 in T cell signaling and the mutual interplay between the channel and other signaling molecules. The prospect of using Kv1.3 as a target for immunosuppressive drugs in therapy further emphasizes the importance of studies focusing on this channel. As channel blockers of high affinity and selectivity are valuable tools for studying ion channel function and, in addition, they may serve as starting points in the development of new immunosuppressive agents, the search for such compounds is always justified. We identified and characterized a new peptide blocker of the Kv1.3 channel and proved that anuroctoxin selectively blocks Kv1.3 with high affinity (Kd = 0.73 nM). Regarding T cell physiology, the most important factor in the pharmacological profile of anuroctoxin is its selectivity for Kv1.3 over IKCa1, the Ca2+-activated K+ channel of human T lymphocytes. Mechanism of Kv1.3 block by anuroctoxin is similar to the block of other scorpion toxins, anuroctoxin is classical pore blocker. Because of its high selectivity for Kv1.3 (anuroctoxin did not block either Kv1.x or Kv2.1 channels), anuroctoxin might be used in clinical practice as an effective immunosuppressive agent to block lymphocyte activation and proliferation in the future. It is generally accepted that functional potassium channels and control of the membrane potential are essential to mitogenic induction of lymphocytes via the regulation of cell volume and cell-mediated cytotoxicity. In our experiments we examined the spatial distribution and association of Kv1.3 and molecules essential in T cell signal transduction to draw conclusions about the role of Kv1.3 in T cell activation based on these molecular interactions. We demonstrated in Jurkat cells and CTLs that the Kv1.3 channel is raft associated and distribution of the channel is nonrandom. We demonstrated a significant domain-level colocalization of Kv1.3/FLAG and CD3 in the Jurkat cell membrane. We showed the enrichment of Kv1.3/FLAG in the immunological synapse formed by CTL-JY cells. We proved that the Kv1.3 channels enter the IS during its development and they undergo a dynamical rearrangement. In conclusion, the results of our studies gave great contribution to the understanding of Kv1.3 function and regulation by the identification of a new high affinity and specificity blocker and the characterization of the distribution of these channels in the plasma membrane of lymphocytes.
Szabadon hozzáférhető
Reaktív nitrogén intermedierek által indukált poli(ADP-ribóz) polimeráz és mátrix metalloproteináz aktiváció vizsgálata in vitro és in vivo
(2006-12-19T10:14:25Z) Bai, Péter; Virág, László; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Általános Orvostudományi Kar -- Orvosi Vegytani Intézet; Elméleti orvostudományok doktori iskola
The characterisation of the biological effects of reactive nitrogen intermediates (RNIs) is an ever-growing area in the field of free radical research. The best characterised RNI is peroxynitrite (ONOO-) formed in the reaction of superoxide and nitric-oxide. ONOO- is capable of nitrating tyrosil residues of proteins, and of breaking the strands of DNA. Enhanced ONOO- production have been detected under different oxidative stress associated pathological states. DNA strand breaks lead to the activation of poly(ADP-ribose) polymerase (PARP), resulting in oncosis due to collapse of the cellular energetic system. PARP inhibition switches oncosis to apoptosis. In our experiments, the cytotoxicity of nitroxyl was investigated. Nitroxyl treatment in thymocytes leads to DNA single strand breaks and mitochondrial dysfunction. Cytotoxicity was attenuated by PARP inhibition, which was accompanied with the switching of the markers of cell death from oncotic to apoptotic (DNA fragmentation, caspase-3 activation, phosphatidyl-serine exposure). Nitroxyl-induced cytotoxicity was partially dependent on PARP activation, however our experiments suggest the dominance of PARP-independent pathways. We have also investigated the possible role of RNIs and PARP inhibition in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Doxorubicin treatment lead to increased nitrotyrosine staining, indicative of peroxinitrite formation. Doxorubicin treatment lead to cardiac muscle cell death, as indicated by increased levels of marker enzymes as CK and LDH. Both PARP inhibition by PJ34 and RNI decomposition by FP15 prevented cardiotoxicity. As a possible novel pathway of cardiotoxicity we have described matrix metalloproteinase (MMP) activation in the heart after doxorubicine treatment. The induction of the newly described MMP was mediated by oxidants. Our results support the pathological significance of the RNI-DNA strand break-PARP activation-oncosis pathway in doxorubicin-induced cardiotoxicity. We also proposed the role of free radical activated MMPs in doxorubicin-induced cardiotoxicity.
Szabadon hozzáférhető
Iszkémia/reperfúzió indukálta károsodások farmakológiai befolyásolási lehetőségei
(2006-12-19T10:26:44Z) Bak, István; Tósaki, Árpád; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Gyógyszerésztudományi Kar -- Gyógyszerhatástani Tanszék; Gyógyszertudományok doktori iskola
Cardiac ischemia/reperfusion is among the most common causes of morbidity and mortality. Decreased oxygen supply and perfusion can cause serious injuries. The overall aims of our studies were to investigate pharmacological approaches capable of reducing ischemia/reperfusion induced damage. In the first part of our experiments we examined the effect of the combined treatment of FK506 (tacrolimus) and EGb 761 (standardized Ginkgo biloba extract). Our results suggest that the combination of these drugs significantly reduces arrhythmias and improves postischemic heart function. The combined therapy could enable to use FK506 in subtoxical doses. This suggests that pharmaceutical interventions incorporating both classes of drug may provide a new and powerful approach to management of ischemic injury associated with heart disease and surgical intervention. It is a general clinical process to use NO in treatment of ischemic heart diseases. Henceforth in the second part of our experiment we studied the role of an other gaseous endogenous monoxide, carbon monoxide, produced by heme oxygenase in prevention of reperfusion induced arrhythmias. Our results indicate that production of endogenous CO significantly decreased in hearts developed ventricular fibrillation. In hearts perfused with PBN, a significant increase in endogenous CO production via the HO-1 mRNA expression was observed, and with the elevation of endogenous CO production, the development of VF was not recorded during reperfusion. Thus, our findings suggest that pharmacological stimulation of the expression of HO-1 could prevent the development of reperfusion-induced arrhythmias. Our last experiments were planed to reveal the way of inhibition of ischemia/reperfusion induced apoptosis. A number of cascade mechanisms have been identified in the induction or inhibition of apoptosis but caspases play a crucial role in this process. Drugs capable of influencing apoptosis are of great importance concerning therapeutic treatment. The most useful method for inhibition of apoptosis could be the inhibition of its universal effectors: the caspases. Both our results and publications of other groups suggest that caspase inhibitors may function as potent agents in treatment of acut ischemic diseases, although it must be noted that apoptosis occurs continuously and almost in all of our organs consequently general inhibition of apoptosis may cause serious clinical injuries.
Szabadon hozzáférhető
Oxidatív stressz hatása a poli(ADP-ribóz) metabolizmusra és a kalcium homeosztázisra humán keratinocita és egér makrofág sejtvonalakban
(2006-12-19T10:29:14Z) Bakondi, Edina; Virág, László; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Általános Orvostudományi Kar -- Orvosi Vegytani Intézet; Elméleti orvostudományok doktori iskola
Various diseases are characterized by oxidative stress, when overproduction of reactive oxygen- and nitrogen-centered intermediates (ROI, RNI) occurs. Reactive species such as peroxynitrite and hydrogen peroxide are capable of causing DNA breakage triggering the activation of the DNA nick sensor enzyme poly(ADP-ribose) polymerase (PARP-1). Activated PARP-1 cleaves NAD+ into nicotinamide and (ADP-ribose), then attaches ADP-ribose residues onto nuclear acceptor proteins, and synthesizes branching polymer chains. PARP-1 fulfills a great number of biological functions ranging from the regulation of DNA repair, chromatin structure, replication, transcription to facilitating telomere elongation. However, overactivation of PARP by ROI and RNI in inflammation, shock and reperfusion injury, leads to necrotic cell death mainly due to depletion of NAD+ and ATP. We have developed three applications: enzyme cytochemistry, enzyme histochemistry and cellular ELISA to detect the activation of poly(ADP-ribose) polymerase in oxidatively stressed cells. and tissues The assays are based on the use of biotinylated NAD+ as PARP substrate. Furthermore, we have investigated the role of poly(ADP-ribose) glycohydrolase (PARG), the main poly(ADP-ribose) catabolyzing enzyme in oxidative stress-induced cytotoxicity. We have found that inhibition of PARG by gallotannin (GT) provided significant cytoprotection to peroxynitrite/hydrogen peroxide treated HaCaT cells (decrease in LDH release, propidium iodide uptake and caspase-3 activation), inhibited depletion of cellular NAD+ pools and caused the accumulation of poly(ADP-ribose) and inhibition of cellular PARP activity. Moreover, we have investigated the possible role of intracellular Ca2+ mobilization and high cell density, in the regulation of sensitivity of HaCaT keratinocytes to oxidative stress-induced cytotoxicity. First we have demonstrated that peroxynitrite triggered an elevation in intracellular calcium levels. Treatment of cells with the cell permeable calcium chelator BAPTA-AM provided significant cytoprotection against peroxynitrite/hydrogen peroxide–induced cytotoxicity. We have also observed that differentiating confluent keratinocytes were highly resistant to oxidative stress. Our results support a crucial role of Ca2+ homeostasis, cell density and poly(ADP-ribose) metabolism in the regulation of oxidative stress-induced cytotoxicity.
Szabadon hozzáférhető
Epigenetic Regulation of Hormonal Response
(2006-12-19T13:49:00Z) Bálint, Bálint László; Nagy, László; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Általános Orvostudományi Kar -- Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet; Elméleti orvostudományok doktori iskola; Elméleti orvostudományok doktori iskola
In order to study the epigenetic components of enhanced retinoid responsiveness we performed an in depth epigenetic characterization of the events taking place on the promoter of a retinoid regulated gene, tissue transglutaminase type 2. As a result of our studies, we propose a new model for the epigenetic regulation of retinoid response and differentiation competence in myeloid leukemia cells. We found that H4R3 methylation, a modification identified previously but withouta well defined biological role, is a hallmark of the primed cell state and precedes gene activation. This modification represents a transcriptional silent (unproductive), but primed state that marks key histones and makes them better substrates for receptor bound acetyltransferases (HAT-s). We propose that this mechanism accounts for the increased susceptibility of the cell to respond to a terminal differentiating agents, such as a retinoid, with increased gene expression and an increased potential for phenotypic differentiation. This model is consistent with the proposal that histone tail modifications function as the physical mediators of cellular memory. By providing docking sites for transcription factors and marking histones for subsequent covalent modifications, these methylation reactions serve as silent switches of gene expression. Our findings suggest an active and physiological role for arginine 3 methylation on H4 tails in retinoid response and provide a model amenable to further investigation and potentially to pharmacological exploitation. In order to further characterize the role of arginine methylation in signal integration and developmental processes we carried out mapping of the genomic loci marked by PRMT1 via histone H4 arginine 3 methylation. We used chromatin immunoprecipitation and cloning to isolate genomic loci marked by H4R3 methylation. After sequencing and in silico analysis we found that all of the genomic hits identified were intronic or at 5‘ end of specific genes. The locations identified were enriched in conserved transcription factor binding sites of POU2F1, MEF-2 and FOXL1 factors. A great number of the genes in the proximity of the identified genomic loci were involving signaling pathways and developmental processes.
Szabadon hozzáférhető
A szérum paraoxonáz aktivitása szekunder dyslipiaemiákban
(2007-01-10T08:08:23Z) Balogh, Zoltán; Paragh, György; Kovács, Péter; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Általános Orvostudományi Kar -- I. sz. Belgyógyászati Klinika; Klinikai orvostudományok doktori iskola
A szérum paraoxonáz aktivitásának vizsgálata a szekunder dyslipidaemiával és felgyorsult atherosclerosissal járó: krónikus veseelégtelenségben, vesetranszplantáció után, 2-es típusú cukorbetegségben. Egyes lipidszintcsökkentő gyógyszerek (gemfibrozil, mikronizált fenofibrát és simvastatin) szérum PON aktivitásra kifejtett hatásának vizsgálata: 2-es típusú cukorbetegekben, illetve hyperlipidaemiás betegekben. Ez utóbbi vizsgálati adatoktól a nagy, többéves, kemény-végpontú klinikai tanulmányok által nagyrészt igazolt jótékony, primer és szekunder prevenciós hatások mellett némi járulékos támpontot remélhetünk a szekunder dyslipidaemiás betegek kezelése során a konkrét gyógyszer kiválasztás folyamatában.
Szabadon hozzáférhető
Akut és késői vesekárosodás daganatos gyermekekben
(2007-01-10T11:01:38Z) Bárdi, Edit; Kiss, Csongor; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Általános Orvostudományi Kar -- Gyermekgyógyászati Klinika; Klinikai orvostudományok doktori iskola
Könnyen kivitelezhető, a glomeruláris filtráció, a proximális és disztális tubulus funkció érzékeny monitorozására alkalmas protokoll kidolgozása. A gyermekonkológiai gyakorlatban gyakran alkalmazott citosztatikumok akut és késői vesekárosító hatásának vizsgálata. Az angiotenzin konvertáló enzim (ACE) gén inszerciós/deléciós (I/D) polimorfizmus szerepének tanulmányozása a vesekárosodás és a súlyos kardiovaszkuláris összeomlás kialakulásában, daganatos gyermekben. A vesekárosodás megelőzésének és kezelési lehetőségeinek vizsgálata, különös tekintettel az antraciklin kezelés esetén a kardiotoxicitás kivédésére alkalmazott dexrazoxan nefroprotektív hatásának vizsgálatára.
Szabadon hozzáférhető
Nem specifikus gyulladásos bélbetegségek klinikai, immunológiai és terápiás vonatkozásai
(2007-01-18T16:06:25Z) Barta, Zsolt; Zeher, Margit; Szabó, Gábor; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Általános Orvostudományi Kar -- Belgyógyászati Intézet -- III. sz. Belgyógyászati Klinika; Klinikai orvostudományok doktori iskola
Jelen munka általában vett célja, hogy klinikánkon az általunk gondozott beteganyagon áttekintsem a nemzetközileg elfogadott kritériumok alapján igazolt betegségek klinikai jellegzetességeit, egyes antitestek előfordulását, a társuló szervspecifikus és szisztémás autoimmun és/vagy allergiás eredetű betegségeket, hogy az immunológiai megfontolásokat is alapul véve új/nem szokványos terápiás kezelési módot alkalmazzunk.
Szabadon hozzáférhető
Emlős cochleaból izolált külső szőrsejtek oldalfalának merevségszabályozása és a cochleáris adaptáció
(2007-01-18T17:25:47Z) Batta, József Tamás; Sziklai, István; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Általános Orvostudományi Kar -- Fül-, Orr-, Gégészeti és Fej-nyaksebészeti Klinika; Klinikai orvostudományok doktori iskola
Az emlős cochlea széles frekvencia-tartományban képes mind az igen alacsony, mind a kifejezetten magas intenzitású hangok érzékelésére. A cochlea sajátos felépítése következt ében egy összetett mechanikai rendszert alkot, mely passzív mechanikai sajátságai önmagukban is alkalmassá teszik a hang frekvencia-specikus érzékelésére. A longitudin ális hangrezgések által kialakított hallócsontláncolati mozgások a perilymphán kereszt ül mozgásba hozzák a membrana basilaris-Corti-szerv-membrana tectoria által alkotott cochleáris hangfelfogó rendszert, mely eredményeként az alaphártyán transzverzális haladóhullámok jönnek létre. Ezen haladóhullámok amplitudómaximuma azok frekvenciaspeci kus helyén alakul ki a cochleán belül. A cochlea ilyen formán létrejövő passzív működése, melynek modelljét Békéssy dolgozta ki 1960-ban, azonban nem elegendő a hangérzékelés tényleges frekvenciafelbontásának és intenzitásszélességének eléréséhez. A cochlea speciális, mechanikailag aktív sejtjei, az un. külső szőrsejtek (OHC) a cochleát egy pontosan szabályozott, aktív hangérzékelő rendszerré alakítják, mely így képessé válik élettani feladatának a betöltésére .
Szabadon hozzáférhető
Antifungális azol-származékok és citokinek hatása normál és kóros hemopoetikus kolóniaképző sejtekre
(2007-01-18T17:35:46Z) Benkő, Ilona; Kovács, Péter; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Általános Orvostudományi Kar -- Gyógyszertani Intézet; Gyógyszertudományok doktori iskola
A gyógyszerek csontvelõtoxicitása különös figyelmet érdemel, ha neutropeniás betegnek adjuk õket, mert még a csekély mértékû myelotoxicitás is ronthatja a prognózist a csontvelõ regenerációjának késleltetésével. Neutropeniás idõszakban szóbajövõ hatóanyagokat vizsgáltunk: Antifungális anyagokat, b-laktamáz-gátlókat, melyek a nagy dózisban esetenként neutropeniát okozó â-laktám antibiotikumok védelmére adhatók, és a csontvelõ citosztatikum-okozta károsodásból való gyógyulását elõsegítõ myelopoetikus és pleiotrop citokineket. Ez utóbbiak hematológiai malignus betegségekben való alkalmazásakor azonban felmerülhet, hogy velük - nem kívánt módon - a malignus sejtek szaporodását is serkenthetjük. A lymphoid leukemiás sejtek myelopoetikus és pleiotrop citokinekkel szembeni érzékenységérõl található irodalom ellentmondó adatokat tartalmaz. E területen végzett kísérleteink új eredményei: 1. Antifungális anyagok hatása a granulocyta-macrophag kolóniaképzõ sejtek (GM-CFU) kolóniaképzésére 1.1. A vizsgált nyolc antifungális azol-származék - a fluconazol kivételével - gátolta a GM-CFU in vitro kolóniaképzését; a fluconazol még a terápiás adagok után észlelhetõ szérumszinteknél lényegesen nagyobb koncentrációban sem gátolta a kolóniák képzõdését. 1.2. E hatás tekintetében az imidazolok és a triazolok nem alkottak elkülönülõ csoportokat. Potencia sorrendjük a human GM-CFU sejtek esetében: itraconazol > saperconazol > clotrimazol > ketoconazol > miconazol > econazol > oxiconazol > fluconazol-krotonát > fluconazol-kapronát > â-fenil-propionil-fluconazol >> fluconazol volt. 1.3. A GM-CFU kolóniaképzésének gátlása összefüggést mutatott az azolok lipophilitását jellemzõ logP értékekkel, amelyek a gátló hatás potencia sorrendjéhez hasonlóan az itraconazol > saperconazol > clotrimazol esetében voltak a legnagyobbak. A vízoldékony fluconazol lipophil származékai jelentõsen toxikusabbak voltak az anyavegyületnél. 1.4. Az egér csontvelõtenyészetekben mért logIC50 adatok jó prediktív értékkel rendelkeztek a human sejt-toxicitás szempontjából. 2. â-laktamázt gátló ã-lakton származékok hatása a GM-CFU kolóniaképzésére Intézetünk új â-laktamázt gátló ã-lakton származékai az anyavegyületnél kevésbé toxikusaknak bizonyultak, a kolóniaképzést nem gátolták jelentõsen. 3. G-CSF, GM-CSF és SCF hatása akut lymphoid leukemiás betegek csontvelõi blast sejtjeire 3.1. A vizsgált myelopoetikus és pleiotrop citokinek (G-CSF, GM-CSF és SCF) - fiziológiás hatásaik alapján nem várt módon stimulálták ALL-es gyermekek leukémiás sejtjeinek kolóniaképzését. A GM-CSF volt a legkevébé hatásos, míg a G-CSF és SCF hatása között nem volt különbség. 3.2. Az öt év alatt vizsgált 13 friss ALL-es gyermek esetében a csontvelõi blast sejtek citokinérzékenysége és a maximális válasz mértéke jelentõs individuális különbségeket mutatott. 3.3. A spontán kolóniaképzést mutató csontvelõminták blast sejtjei valamennyi citokin hatására magasabb kolóniaszámokkal reagáltak, mint az exogen citokinek hozzáadása nélkül kolóniákat nem képzõk. 3.4. A G-CSF, GM-CSF és SCF kombinációi az egyes citokinekkel önmagukban nem stimulálható esetekben is képesek voltak az ALL-es blastok kolóniaképzését kiváltani. Minden esetben a hármas kombináció hatására nõtt a legtöbb kolónia. 3 3.5. Az elõbbieket ALL-es betegek citokin-kezelésénél érdemes figyelembe venni. Az in vitro kolóniaképzõdés vizsgálata segíthet az egyes betegeknél a citokinek lehetséges hatásainak elõzetes felmérésében.
Szabadon hozzáférhető
Molecular determinants of co-regulator binding and transcriptional activity of the retinoic acid receptor - retinoid X receptor heterodimer
(2007-01-18T17:39:58Z) Benkő, Szilvia; Nagy, László; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Általános Orvostudományi Kar -- Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet; Elméleti orvostudományok doktori iskola
A génexpresszió szabályozásának transzkripciós kontrollja az élőlények megfelelő fejlődése szempontjából nélkülözhetetlen. A magreceptorokon és azok koregulátorain végzett biokémiai és szerkezeti vizsgálatok segítséget nyújtottak működésük mechanizmusának megértésében. A módszerekkel nyert információ világossá tette, hogy a magreceptorok megfelelő működése egy komplex, allosztérikus összhangot feltételez az LBD funkcionális doménjei között. Doktori munkám során azt a célt tűztük ki, hogy tanulmányozzuk az RAR és RXR molekulák koregulátor kötő képességét, a tényezőket melyek meghatározzák és befolyásolják működésüket, továbbá megkíséreltünk kapcsolatot találni a koregulátor kötés és a transzkripciós szabályozás között. Ezen munkák során lehetőségem volt számos modern molekuláris biológiai és biokémiai módszer elsajátítására és felhasználására. Ezen technikák segítségével meghatároztuk az RAR-LBD felszínén a korepresszor kötő területet. Összehasonlítva a korepresszor- és koaktivátor kötő felszínt megállapítottuk, hogy ezek átfedő régióban kötődnek egymáshoz. A koregulátor kötőhely mellet olyan oldalláncokat is azonosítottunk, melyek a H12 pozícionálásán keresztül befolyásolják a koregulátor kötődését. H12 deléciós mután RXR moolekulát használva azt találtuk, hogy az RXR csökkenti a partner receptor korepresszor kötését. Eredményeink továbbá azt is mutatják, hogy az RXR-H12 deléciója megváltoztatja a koregulátorkötő egyensúlyt és ez a partner receptor aktivitásának gyengítését eredményezi. Végeredményben azt mondhatjuk, hogy vizsgálataink hozzájárultak ahhoz az erősödő nézethez, miszerint a H12 pozíciója, dinamikája és stabilitása jelentős szerepet játszik magreceptorok transzkripciós aktivitásának szabályozásában. Eredményeink továbbá megegyeznek azokkal a korábbi eredményekkel, melyek bizonyítják a H12 szükségességét a transzaktivációban, a koaktivátor kötő felszín kialakításában, valamint a H12 delécióját ill. mutációját célzó kísérletek igazolják olyan domináns negatív receptor létrejöttét, mely fokozott korepresszor kötő képességel bír. Eredményeink bizonyítják, hogy a H12 aktív pozícióját befolyásoló oldalláncok szintén nagy mértékben hozzájárulnak a korepresszor és koaktivátor kötés egyensúlyának kialakításához. Ezek az eredmények a későbbiekben hozzájárulhatnak olyan mutáns receptorok tervezéséhez, melyek jóval szélesebb spektrumú aktiválásra képesek, mint amit korábban fetételeztek.
Szabadon hozzáférhető
Primer és secunder hyperparathyreosis sebészi kezelése
(2007-01-18T17:44:16Z) Berczi, Csaba; Lukács, Géza; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Általános Orvostudományi Kar -- II. sz. Sebészeti Klinika; Klinikai orvostudományok doktori iskola
1. A primer hyperparathyreosisos betegekben végzett parathyroidectomia az esetek 99 %-ában eredményes volt. A műtétet követően a szérum calcium és parathormon szint csökkent. 2. Összegzésül megállapítjuk, hogy primer HPT esetén az alkalmazott preoperatív lokalizációs eljárások közül a Technetium-99m-sestamibi / Technetium-99m-pertechnetát izotóp szcintigráfia szenzitivitása bizonyult a legmagasabbnak. Azt tapasztaltuk, hogy a Technetium-99m-sestamibi / Technetium-99m-pertechnetate radioizotóp vizsgálat szenzitivitása szignifikánsan magasabb volt a mellékpajzsmirigy adenomák, mint a hyperpláziás mirigyek ábrázolására. Vizsgálataink során a subtractiós izotóp vizsgálat magas szenzitivitással ábrázolta mind a típusos helyen, mind az ektópiásan elhelyezkedő mirigyeket. 3. Megállapíthatjuk, hogy Technetium-99m-sestamibi / Technetium-99m-pertechnetate scan preoperatív alkalmazása kétoldali nyaki feltárással kombinálása segítséget nyújt a perzisztens és rekurrens HPT előfordulási gyakoriságának csökkentéséhez. 4. Tapasztalataink alapján a vizsgált szcintigráfiának magas a szenzitivitása, mely alkalmassá teszi arra, hogy adenoma esetén a parathyroidectomia egyoldali nyaki feltárásból vagy minimál invazív beavatkozással történjen. 5. A primer HPT következtében kialakult osteoporosisos esetekben megfigyeltük, hogy a műtétet követően a calcium, AP és PTH szint csökkenése, normalizálódása következik be. A parathyroidectomiák után rövid időn belül az L II-IV gerincszakaszon a BMD szignifikánsan fokozódik. Eredményeink alapján azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a sikeres parathyroidectomiát követően az esetek jelentős részében nincs szükség antireszorptív terápiára. 6. A DNS vizsgálatok során azt tapasztaltuk, hogy a normális működésű mellékpajzsmirigyek diploid DNS tartalommal rendelkeznek, míg az aneuploid DNS tartalom előfordulása gyakori a fokozott működésű mellékpajzsmirigyekben. Az a véleményünk, hogy a flow-cytometriás DNS analísis nem alkalmas módszer az adenomák és a hyperpláziás mirigyek elkülönítésére, mert mindkét esetben gyakori a DNS aneuploiditás. Aneuploid DNS tartalom és magas PI esetén a mellékpajzsmirigy adenoma és hyperplázia miatt operált betegek szoros követése javasolt a lehetséges malignus potenciál miatt. 7. A mellékpajzsmirigy karcinómákban mind diploid DNS, mind aneuploid DNS tartalom előfordulhat. DNS aneuploid karcinóma esetén gyakran fordult elő nyirkcsomó metasztázis. Más eredményekhez hasonlóan, a mi eredményeink is azt vetik fel, hogy a DNS aneuploiditás esetén csökken a betegek túlélése. 8. Secunder hyperparathyreosisban szubtotális parathyroidectomiát vagy autotranszplantációval együtt végzett totális parathyroidectomiát követően a klinikai tünetek jelentős részének javulása és a PTH koncentráció csökkenése figyelhető meg. A perzisztens HPT kialakulását az elégtelen számú mellékpajzsmirigy eltávolítás okozza. Véleményünk szerint a megfelelően végzett parathyroidectomia után az esetek csekély részében alakul ki perzisztens vagy rekurrens HPT. 9. A veseátültetés javulást eredményez a calcium- és csontanyagcsere-zavarban, de az immunszuppresszív terápia erre a folyamatra kedvezőtlenül hat. Betegeink kórtörtének áttekintése során megfigyeltük, hogy a calcium- és csontanyagcserére jellemző szérum ionszintek a betegek nagyrészében normalizálódnak a transzplantációt követően. Mind a calciummal, mind az alfacalcidollal kezelt csoportban csökkent a PTH koncentráció. Azt tapasztaltuk, hogy a PTH koncentráció csökkenése az alfacalcidol terápiát kapott csoportban kifejezettebb volt. Az észlelt kedvező változások ellenére az még az alfacalcidol terápia alkalmazása mellett is a recipiensek jelentős része osteopeniás.
Szabadon hozzáférhető
Pharmacogenetics of CYP2D6: clinical implications in psychiatric patients treated with antipsychotic drugs
(2007-01-18T17:53:54Z) Berecz, Roland; Llerena, Adrián; Degrell, István; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Általános Orvostudományi Kar -- Pszichiátriai Tanszék; Klinikai orvostudományok doktori iskola
A CYP2D6 enzim fontos tényezőnek igazolódott a vizsgált antipszichotikumok metabolizmusában. A genetikailag meghatározott enzimaktivitás mellett a környezeti tényezők (adag, konkomittáns kezelés, dohányzás) befolyásolják az enzim aktivitását. Az aktivitás változásoknak klinikai következményei is vannak. Részletes következtetések: 1. Az antipszichotikumok plazmakoncentrációjának mérésére kifejlesztett HPLC módszerek hatékony és megbízható módszernek bizonyultak a gyógyszerek és metabolitjaik plazmaszint mérésére. 2. Klinikailag használt adagok mellett a tioridazin és a haloperidol dózis függően gátolja a CYP2D6 enzimet, a risperidon esetében ilyen hatást nem találtunk. 3. A CYP2D6 enzim aktivitás befolyásolja a tioridazin, haloperidol és risperidon plazmakoncentrációját. Ez a hatás a három gyógyszerre eltérő mértékű. 4. A tioridazin/mesoridazin és a risperidon/9-hidroxi-risperidon ráta klinikailag információt nyújthat a CYP2D6 enzim aktivitásáról. 5. A dohányzás erősen csökkentette a tioridazin plazmakoncentrációját; a haloperidol esetében ez a hatás nem szignifikáns, míg a risperidon esetében nem találtunk ilyen hatást. 6. Konkomittáns kezelés befolyásolja a risperidon lebomlását. A CYP2D6 erős inhibitorokkal folytatott párhuzamos kezelés esetén risperidon plazmakoncentrációja jelentősen megváltozik. 7. Az extrapiramidális mellékhatások megjelenése kapcsolatban állhat a risperidon plazmakoncentrációjával. 8. A tioridazin QTc intervallum növelő hatása kapcsolatban áll a gyógyszer adagjával, plazmakoncentrációjával és a CYP2D6 enzim aktivitásával. 9. Farmakokinetikai vizsgálatok segítséget nyújthatnak klinikailag jelentős mellékhatások vizsgálatában. Egy ilyen tényezőt igazoltunk a klozapin megvonási tünetek esetében.
Szabadon hozzáférhető
Egy pleiotróp hatású autoregulátor molekuláris genetikai analízise Streptomyces griseusban
(2007-01-18T18:06:34Z) Birkó, Zsuzsanna; Biró, Sándor; Elméleti orvostudományok doktori iskola; Hádáné Birkó, Zsuzsanna; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Általános Orvostudományi Kar -- Humángenetikai Intézet; Elméleti orvostudományok doktori iskola
Az Intézetünkben felfedezett C faktor az első tiszta formában előállított, Streptomycesekben azonosított fehérje természetű autoregulátor. A munka során a C faktort a bevezetésben taglalt szempontok szerint molekuláris genetikai módszerek alkalmazásával vizsgáltuk. Azonosítottuk a C faktor fehérje génjét, meghatároztuk szekvenciáját és a szekvenciából levezethető aminosav sorrendet. Az aminosav sorrend alapján nem igazolódott az a korábbi feltevés, hogy a C faktor cink-ujj típusú szabályozó fehérje. A komputeres analízist kiegészítve meghatároztuk a fehérje néhány, a szekvencia jelentős részét lefedő, triptikus fragmentjének aminosav sorrendjét is. A C faktor fehérje kiválasztásra kerül a sejtből, a 38 aminosavból álló szekréciós szignálszekvenciájában található twin-arginin motivum valószínűleg a Sec független Tat transzlokációs útvonalhoz irányítja, mely a Sec szekréciós úttól eltérően a fehérjéket harmadlagos illetve negyedleges szerkezetük kialakulása után és ezt megtartva választja ki a sejtből. Az érett fehérje valószínűleg rendelkezik egy transzmembrán régióval, amin keresztül képes a differenciálódás korai stádiumában lévő hifák membránjába integrálódni úgy, hogy N-terminális vége a sejt belső tere felé, míg C-terminális vége az extracelluláris tér felé mutat. A C faktor fehérje egyetlen eddig ismert és adatbankokban hozzáférhető fehérjével sem mutat szignifikáns homológiát. Előfordulása a Streptomyceseken belül nem általános, génjét illetve a vele nagyfokban homológ gént csak folyékony tápközegben jól spórázó törzsekben sikerült kimutatni. A fehérje termelése életciklus függő, az mRNS szintje a sporulációt megelőző stádiumban emelkedik meg. Meghatároztuk a transzkripciós start pontot, ami alapján megállapított -10-es és -35-ös promóter régió szekvencia homológiája szerint, a gén átírásában valószínűleg a σhrdB faktor játszik szerepet. A C faktor morfológiai differenciálódás szabályozásában betöltött szerepére vonatkozólag megállapítható, hogy szilárd táptalajon C faktort nem termelő S. griseus NRRLB-2682 kopasz mutánsában, különböző génekben történt defektus esetén is, légmicélium képzést indukál, illetve befolyásolja a sporuláció folyamatát. Folyékony tápközegben pedig, az ilyen körülmények között nem spórázó, C faktor génjét szintén nem tartalmazó S. griseus 52-1 teszt törzsünkben preconidium képzésben játszik szerepet. A C faktor nagy valószínűséggel a légmicélium illetve spóra képzést érintő zavarok szupresszoraként működik közre, de még nem ismert, hogy mely regulációs kaszkád tagjaként. Annak érdekében, hogy a vele kölcsönható fehérjét, illetve fehérjéket azonosítani tudjuk létrehoztuk a C faktor C-terminálisan His-farkazott változatát, melyet nagyobb mennyiségben csak E. coli expressziós rendszerben tudtunk termeltetni. A S. griseus 52-1 törzsből egy 55 és egy 110 kD molekulatömegű a C faktorral feltehetően kölcsönható fehérjét sikerült azonosítani. Az antibiotikum szintézisre gyakorolt hatásáról megállapítható, hogyha a transzformálandó törzs eredetileg nem termel streptomycint, akkor a C faktor alacsony kópiaszámban fokozza az antibiotikum termelést, magas kópiaszámban hatása már nem ilyen egyértelmű. Abban az esetben, ha a transzformálandó törzs eredetileg termel streptomycint, a C faktor sem magas, sem alacsony kópiaszámban nem növeli a szintézis mértékét.
Szabadon hozzáférhető
C. elegans protein diszulfid izomeráz transzglutamináz aktivitásának vizsgálata
(2007-01-18T18:13:04Z) Blaskó, Bernadett; Fésüs, László; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Általános Orvostudományi Kar -- Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet; Elméleti orvostudományok doktori iskola
1.Sikeresen klónoztuk a C. elegans PDI-3 cDNS-ét egy indukálható, expressziós vektorba, melynek segítségével előállítottuk a rekombináns fehérjét (rPDI-3). 2.A rekombináns fehérje mind in vitro, mind in vivo kísérletekben aktívnak bizonyult. Az rPDI-3 diszulfid izomeráz aktivitását meghatároztuk, és bizonyítottuk, hogy képes komplementálni a dsbA- deficiens E. coli törzset. 3.A rekombináns fehérje transzglutamináz aktivitással rendelkezett, erről két független mérési módszerrel is megbizonyosodtunk. A transzglutamináz aktivitás csak 55 °C-on volt detektálható, 25 °C-on nem. Meggyőződtünk arról, hogy nem artefactumról van szó, a PDI valóban katalizálja az amin- transzfert a kazein és biotinált amin között, ezt dot blot kísérlettel is igazoltuk. A rekombináns PDI specifikus aktivitását is megmértük, azt a tengerimalac szöveti transzglutaminázával nagyságrendben összehasonlítható értéket adott. 4.Deléciós mutánsok segítségével sikerült lokalizálnunk, hogy a detektált transzglutamináz aktivitásért a fehérje tioredoxin doménje a felelős. 5.Hely-specifikus mutagenezissel kimutattuk, hogy a rekombináns PDI-3 TGáz aktivitása független a PDI katalitikus centrumában található cisztein oldalláncoktól. 6.A tioredoxin domén mutagenezise bebizonyította, hogy a transzamidációban a CGHC tioredoxin motívumban található második cisztein játszik kritikus szerepet. 7.A vizsgált E. coli és humán tioredoxin is transzglutamináz aktivitást mutatott. 8.Mivel tioredoxin doménban egyetlen hisztidin található, ezért megvizsgáltuk, hogy vajon szerepet játszik-e a transzamidációs reakcióban. A hisztidin oldallánc kémiai módosítása a TGáz aktivitás szinte teljes elvesztését eredményezte. Szekvencia összehasonlításokkal két konzerválódott Asp régiót találtunk mind a PDI-ben, mind a tioredoxinban. A PDI-ben, és Trx-ben lehetséges katalitikus triádokat azonosítottunk. Homológ modellezés segítségével megszerkesztettük a C. elegans PDI-3 a doménjának a szerkezetét. 9.Cirkuláris dikroizmus spektroszkópia segítségével kimutattuk, hogy mind a PDI, mind a Trx egy hőmérséklet-indukálta szerkezetváltozáson megy keresztül, ami szükséges feltétele a transzglutamináz reakció in vitro lejátszódásához.

Böngészés

PhD dolgozatok Megjelenés dátuma szerinti böngészés

Találat egy oldalon

Rendezési lehetőségek