Inszerciós mutagenezis alkalmazása szterinlebontásért felelős mycobacterium gének megismerésében

Absztrakt

A Tn611 transzpozont hordozó pCG79 jelű hőérzékeny ingázó plazmid DNS alkalmazásával inszerciós mutáns könyvtárakat hoztunk létre szterin-hasznosító Mycobacterium smegmatis mc2155 és Mycobacterium phlei M51-Ept törzsekben szterin-átalakító képességben blokkolt mutánsok előállítása céljából. Nagy-áteresztőképességű szűrőmódszerrel 10-10 ezer törzset vizsgáltunk le mindegyik inszerciós mutáns könyvtárból. Összesen 4 törzset találtunk, amelyek szterinlebontó enzimaktivitásai különböztek a szülői törzsekétől. A 4-androsztén-3,17-diont termelő Mycobacterium phlei M51-Ept egyik blokkmutánsa a szitoszterint 23,24-dinorkolánvázas vegyületekké alakította át, amelyek hasznos kiindulási anyagai a kortikoszteroid gyógyszerek szintézisének. A 3-ketoszteroid-9α-hidroxiláz aktivitásban gátolt Mycobacterium smegmatis 10A12 jelű blokkmutáns genomiális DNS-éből egy pFJ92-nek elnevezett rekombináns plazmidot nyertünk ki, amely tartalmazta a kromoszómába integrálódott transzpozont és a kapcsolódó kromoszómális régiókat. A pFJ92 plazmidot használtuk fel a 9α-hidroxilázt kódoló kromoszómális DNS izolálására. Az izolált ORF kódolja a 383 aminosavat tartalmazó 3-ketoszteroid-9α-hidroxiláz enzimet M. smegmatis mc2155-ben, amelyben jelen vannak az IA osztályba tartozó terminális oxigenázokban jellemzően konzervált domének. Az izolált génnel transzformált Escherichia coli képessé vált a szterán váz 9α-hidroxilezésére.

Integration of the pCG79 temperature-sensitive plasmid carrying Tn611 was used to generate libraries of mutants with blocked sterol transforming ability of the sterol-utilizing strains Mycobacterium smegmatis mc2155 and Mycobacterium phlei M51 Ept. Of the 10,000 insertional mutants screened from each library, four strains with altered activity of the sterol-degrading enzymes were identified. A blocked mutant of the 4-androstene-3,17-dione-producing M. phlei transformed sitosterol to 23,24-dinorcholane derivatives that are useful starting materials for corticosteroid syntheses. A recombinant plasmid, pFJ92, was constructed from the genomic DNA of one of the insertional mutants of M. smegmatis, 10A12, which was blocked in 3-ketosteroid 9α-hydroxylation and carrying the transposon insertion and flanking DNA sequences, and used to isolate a chromosomal fragment encoding the 9α-hydroxylase. The open reading frame encodes the 383-amino acid terminal oxygenase of 3-ketosteroid 9α-hydroxylase in M. smegmatis mc2155 and has domains typically conserved in class IA terminal oxygenases. Escherichia coli containing the gene could hydroxylate the steroid ring at the 9α-position.

Leírás
Kulcsszavak
3-ketoszteroid-9α-hidroxiláz, 3-ketosteroid 9α-hydroxylase, oldallánc lebontás, blokkmutáns, szteroid gyógyszer, szitoszterin, intermedier, szterinlebontási útvonal, inszerciós mutáns könyvtár, Mycobacterium phlei, Mycobacterium smegmatis, gén, side chain degradation, blocked mutant, steroid drug, sitosterol, intermediate, sterol degradatoin pathway, insertional mutant library, Mycobacterium phlei, Mycobacterium smegmatis, gene
Forrás