A PAF antifungális fehérje és variánsainak letekeredése dimetil-szulfoxid hatására

Dátum
Folyóirat címe
Folyóirat ISSN
Kötet címe (évfolyam száma)
Kiadó
Absztrakt

A vizsgálat tárgya a PAF fehérje és annak néhány pontmutánsa volt; korábban a PAF hideg-meleg letekeredését már vizsgálták NMR-el, jelen munkában ezt a kémiai denaturálás módszereivel kívántuk kiegészíteni, amihez dimetil-szulfoxidot (DMSO) alkalmaztunk. A vizsgált négy fehérje esetén a DMSO koncentráció függvényében a mért termogramokból meghatároztam a Tm olvadáspont és a dH letekerési entalpia változását. A Tm lineáris csökkenése igazolja a DMSO denaturáló hatását, ami - a fehérje változattól függetlenül - hasonlóan érzékeny a DMSO koncentrációra. A DMSO nélküli pufferben D19S változat Tm értéke a legkisebb (+91.6 °C). Bár a dH értékelése kevésbé megbízható, az előzetes eredmények szerint értéke a natív PAF-ra volt a legnagyobb, ami a natív forma nagyobb stabilitására utal. A PAF esetén a DMSO koncentráció függvényében állandó (+37 °C) hőmérsékleten követtük a 15N HSQC spektrumok NMR jeleinek eltolódását és intenzitását. Hat reprezentatív csúcs elemzésével, kétállapotú modellt feltételezve megállapítható volt a DMSO indukálta letekeredés dG szabad entalpiája [~ 23 kJ/M] és ~70 v/v% (9.7M) DMSO koncentrációnál a PAF fele már letekeredett, az 50 v/v % (7M) DMSO-t tartalmazó, +37 °C hőmérsékletű oldatban a PAF 15N NMR relaxációs paramétereit (T1, T2, 15N/1H NOE) értékelve a Lipari-Szabó módszerrel a rend paraméterre inkább a rendezett fehérjékre jellemző magas (S2 ~ 0.8-0.9) értékeket kaptuk, néhány lokális kivételtől eltekintve (2, 11, 19, 31, 49) a flexibilis loop régiókban. Ez arra utal, hogy az NMR kísérleteinkben valójában csak a feltekeredett PAF-ot tudjuk detektálni, és a jelintenzitások csökkenéséből tudunk következtetni a letekeredésre, azonban a feltekert PAF kémiai eltolódásai eltérő módon reagálnak a DMSO titrálásra, így valószínűsíthető, hogy a PAF térszerkezete is módosul DMSO jelenlétében.

Leírás
Kulcsszavak
DMSO, PAF, DSC, NMR, fehérje, letekeredés, antifungális
Forrás