Az ErbB receptorok konstitutív és ligand indukált asszociációinak kvantitatív jellemzése

Nagyné Szabó, Ágnes Tímea

Az ErbB receptorok konstitutív és ligand indukált asszociációinak kvantitatív jellemzése

dc.contributor.advisor	Szöllősi, János
dc.contributor.advisor	Nagy, Péter
dc.contributor.author	Nagyné Szabó, Ágnes Tímea
dc.contributor.authorvariant	Szabó, Ágnes Tímea
dc.contributor.department	Molekuláris orvostudomány doktori iskola	hu
dc.contributor.submitterdep	DE--OEC--Általános Orvostudományi Kar -- Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet
dc.date.accessioned	2011-04-19T08:25:36Z
dc.date.available	2011-04-19T08:25:36Z
dc.date.created	2011	hu_HU
dc.date.defended	2011-05-04
dc.description.abstract	Az ErbB1 és az ErbB2 homoasszociátumok kvantitatív jellemzéséhez kidolgoztunk egy áramlási citométeren alkalmazható módszert, mely homo-FRET mérésén alapszik. Az ErbB1 és az ErbB2 receptorokat megjelölve különböző arányban összekevert fluoreszcensen jelölt és jelöletlen antitesttel mértük a spektroszkópiailag azonos molekulák között kialakult homo-FRET kölcsönhatást. Ha sok fluorofór van egymáshoz közel (10 nm-en belül), akkor az energia szétoszlik az adott klaszterben. A homo-FRET egyetlen manifesztációja a fluoreszcencia anizotrópia csökkenése, aminek mértéke függ a fluorofórok koncentrációjától. A koncentrációtól függő anizotrópia csökkenés megmutatja, hogy a vizsgált molekula monomert, dimert, trimert vagy magasabb rendű oligomert alkot. Nyugalomban lévő A431 sejteken az ErbB1 receptorok legnagyobb része monomer formában van jelen, és EGF vagy szérum stimulálás hatására nő az ErbB1 homoklaszterek mérete, hiszen az EGF az ErbB1 ligandja lévén fokozza homoasszociációját. Ezzel szemben stimulálatlan SKBR-3 sejtek felszínén az ErbB2 fehérjék legnagyobb része inaktivált állapotban van jelen nagyméretű homoasszociátumokban, melynek mérete lecsökken EGF, heregulin vagy szérum stimulálás hatására, hiszen a ligandok által aktivált ErbB1 és ErbB3 receptorok ErbB2 molekulákat szakítanak ki a homoklaszterekből azért, hogy az ErbB2-vel heterodimerizálódjanak. A heteroasszociátumok kvantitatív jellemzéséhez a méréseket konfokális mikroszkópon végeztük az általunk kidolgozott FSAB technikát felhasználva. Ez azon alapul, hogy egy fotostabil donor molekulát gerjesztve csak azok a fotolabilis akceptor molekulák égnek ki, melyek elég közel vannak a donorhoz, hogy közöttük hetero-FRET jöhessen létre. Így meghatározható az akceptor molekulák azon aránya, melyek a donorral egy klaszterben vannak. A kísérletek során az Alexa546 festéket használtuk fotostabil donorként, míg a Cy5 fluorofór volt a fotolabilis akceptor. Nem stimulált SKBR-3 sejtek felszínén az ErbB1 receptorok közel fele heteroklasztert alkot az ErbB2 fehérjével, és ez az arány nem változik szignifikánsan EGF stimulálás hatására, hiszen az EGF elősegíti az ErbB1 homodimerizációja mellett az ErbB1-ErbB2 heterodimerizációt is. Ezzel szemben az ErbB2-nek mindössze 10%-a van heteroasszociátumban az ErbB1 molekulával nyugalomban lévő SKBR-3 sejteken, mely megduplázódik EGF stimulálás hatására. Az ErbB2 stimulálatlan sejtek felszínén nagyméretű homoasszociátumokat alkot, amiből EGF hatására az ErbB1 ErbB2 molekulákat szakít ki. Az általunk leírt nagyméretű klaszterek az ErbB fehérjék által mediált szignáltranszdukció helyszínei, melyekben ligandkötés hatására átrendeződések mennek végbe. A stimulálatlan sejteken jelenlévő nagyméretű ErbB2 asszociátumok biztosítják a ligandkötés hatására létrejövő aktív ErbB1 és ErbB3 molekulák számára a heterodimerizációhoz az ErbB2 proteineket könnyen elérhető módon. A növekedési faktorok által aktivált jelátvitel számára kedvező, hogy a nagyméretű klaszterekben a receptorok magas lokális koncentrációban vannak jelen. A klaszterek ilymódon a fiziológiás és kóros jelátvitel helyszínei, melyek pontosabb megismerése közelebb vihet bennünket a daganatos sejtburjánzást kiváltó jelátviteli útvonalak gátlásához. We presented a statistically reliable, flow cytometric homo-fluorescence resonance energy transfer (homo-FRET) method for quantitative characterization of the homoassociation of ErbB1 and ErbB2. ErbB1 and ErbB2 receptors were labeled by a mixture of unlabeled and fluorescent antibodies and homo-FRET was measured between two spectroscopically identical fluorophores. The excitation energy is distributed in the ensemble of molecules by homo-FRET. The only manifestation of homo-FRET is decreased fluorescence anisotropy which depends on the concentration of fluorophores. The decrease in the concentration dependent anisotropy shows whether the molecule is monomeric, dimeric, trimeric or forms higher order oligomers. In quiescent A431 cells most ErbB1 receptors are monomeric and stimulation with EGF or serum leads to an increase in the cluster size of ErbB1 due to ligand-induced homodimerization of ErbB1. On the contrary, most of the ErbB2 proteins are inactivated and present in large homoclusters in unstimulated SKBR-3 cells whose size decreases upon EGF, heregulin or serum stimulation. We attribute this phenomenon to the recruitment of ErbB2 to heterodimers with ligand-activated ErbB1 and ErbB3 resulting in the removal of ErbB2 from homoclusters. We developed the FRET-sensitized acceptor bleaching (FSAB) technique to quantitate the ratio of ErbB1 and ErbB2 in their heteroclusters by confocal microscopy. Briefly, a photostable donor excites a photolabile acceptor by FRET, and the acceptors within FRET distance to the donor will get photobleached and the fraction of acceptor molecules in the vicinity of donors can be determined. Alexa546 and Cy5 fluorophores were used as a photostable donor and a photolabile acceptor, respectively. In unstimulated SKBR-3 cells almost half of ErbB1 receptors form heteroclusters with ErbB2 and after EGF treatment, the fraction of heteroclustered ErbB1 did not change significantly, because EGF induces the formation of both ErbB1 homodimers and ErbB1-ErbB2 heterodimers. On the contrary, only 10% of ErbB2 is in heteroclusters with ErbB1 in quiescent SKBR-3 cells and this fraction doubles upon EGF stimulation, because ligand-activated ErbB1 recruits ErbB2 proteins from the large ErbB2 homoclusters. The large-scale clusters described by us are the place of signal transduction mediated by ErbB receptors where rearrangements take place upon ligand binding. The large ErbB2 homoassociations present in quiescent cells ensure that ErbB2 proteins are easily accessible for ligand-activated ErbB1 and ErbB3 to form heteroclusters. The receptors in large clusters are present in high local concentration which is favorable for signal transduction activated by growth factors. In this way the clusters are the places of physiological and pathological signal transductions. A better understanding of these clusters may shed light on the mechanisms of malignant cell proliferation and its inhibition.	hu_HU
dc.description.corrector	NE
dc.format.extent	89	hu_HU
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/2437/104746
dc.language.iso	hu	hu_HU
dc.language.iso	en	hu_HU
dc.subject	ErbB fehérjék	hu_HU
dc.subject	ErbB proteins	hu_HU
dc.subject	fehérje klaszter	hu_HU
dc.subject	protein clustering	hu_HU
dc.subject	homo-FRET	hu_HU
dc.subject	anizotrópia	hu_HU
dc.subject	anisotropy	hu_HU
dc.subject	áramlási citometria	hu_HU
dc.subject	flow cytometry	hu_HU
dc.subject	FRET-szenzitizált akceptor fotoelhalványítás	hu_HU
dc.subject	FRET-sensitized acceptor bleaching	hu_HU
dc.subject	konfokális mikroszkópia	hu_HU
dc.subject	confocal microscopy	hu_HU
dc.subject.discipline	Elméleti orvostudományok	hu
dc.subject.sciencefield	Orvostudományok	hu
dc.title	Az ErbB receptorok konstitutív és ligand indukált asszociációinak kvantitatív jellemzése	hu_HU
dc.title.translated	Quantitative description of the constitutive and ligand-induced associations of ErbB receptors	hu_HU