A Tn611 transzpozont hordozó pCG79 jelű hőérzékeny ingázó plazmid DNS alkalmazásával inszerciós mutáns könyvtárakat hoztunk létre szterin-hasznosító Mycobacterium smegmatis mc2155 és Mycobacterium phlei M51-Ept törzsekben szterin-átalakító képességben blokkolt mutánsok előállítása céljából. Nagy-áteresztőképességű szűrőmódszerrel 10-10 ezer törzset vizsgáltunk le mindegyik inszerciós mutáns könyvtárból. Összesen 4 törzset találtunk, amelyek szterinlebontó enzimaktivitásai különböztek a szülői törzsekétől. A 4-androsztén-3,17-diont termelő Mycobacterium phlei M51-Ept egyik blokkmutánsa a szitoszterint 23,24-dinorkolánvázas vegyületekké alakította át, amelyek hasznos kiindulási anyagai a kortikoszteroid gyógyszerek szintézisének. A 3-ketoszteroid-9α-hidroxiláz aktivitásban gátolt Mycobacterium smegmatis 10A12 jelű blokkmutáns genomiális DNS-éből egy pFJ92-nek elnevezett rekombináns plazmidot nyertünk ki, amely tartalmazta a kromoszómába integrálódott transzpozont és a kapcsolódó kromoszómális régiókat. A pFJ92 plazmidot használtuk fel a 9α-hidroxilázt kódoló kromoszómális DNS izolálására. Az izolált ORF kódolja a 383 aminosavat tartalmazó 3-ketoszteroid-9α-hidroxiláz enzimet M. smegmatis mc2155-ben, amelyben jelen vannak az IA osztályba tartozó terminális oxigenázokban jellemzően konzervált domének. Az izolált génnel transzformált Escherichia coli képessé vált a szterán váz 9α-hidroxilezésére.

Integration of the pCG79 temperature-sensitive plasmid carrying Tn611 was used to generate libraries of mutants with blocked sterol transforming ability of the sterol-utilizing strains Mycobacterium smegmatis mc2155 and Mycobacterium phlei M51 Ept. Of the 10,000 insertional mutants screened from each library, four strains with altered activity of the sterol-degrading enzymes were identified. A blocked mutant of the 4-androstene-3,17-dione-producing M. phlei transformed sitosterol to 23,24-dinorcholane derivatives that are useful starting materials for corticosteroid syntheses. A recombinant plasmid, pFJ92, was constructed from the genomic DNA of one of the insertional mutants of M. smegmatis, 10A12, which was blocked in 3-ketosteroid 9α-hydroxylation and carrying the transposon insertion and flanking DNA sequences, and used to isolate a chromosomal fragment encoding the 9α-hydroxylase. The open reading frame encodes the 383-amino acid terminal oxygenase of 3-ketosteroid 9α-hydroxylase in M. smegmatis mc2155 and has domains typically conserved in class IA terminal oxygenases. Escherichia coli containing the gene could hydroxylate the steroid ring at the 9α-position.