A poli-ADP-riboziláció szerepének vizsgálata SaOS sejtek differenciálódásának szabályozásában

Abstract

Az oszteoszarkóma a leggyakoribb primer csontdaganat, amelyre jellemző a tumor sejtek direkt csontszövet-, illetve osteoid termelése. Vizsgálatainkat SaOS-2 sejtvonalon végeztük, mely egy oszteoszarkóma eredetű osteoblast epitél sejtvonal.A SaOS-2 sejtek részletesen jellemzettek, magas osztódási rátával bírnak, alkalikus foszfatáz aktivitásuk révén megfelelő médium jelenlétében képesek kalcium depozícióra, íly módon megfelelő modellrendszernek tekinthetők a csont differenciálódás vizsgálatára.A poli-ADP-riboziláció egy reverzibilis poszttranszlációs módosítás. A poli(ADP-ribóz) polimeráz-1 (PARP-1) aktiválódását követően szubsztrátját, a NAD+-ot nikotinamidra és ADP-ribózra hasítja, melyet fehérjék glutamát és aszpartát oldalláncácához kapcsolva hosszú, elágazó polimert szintetizál. A poli(ADP-ribóz) polimerek életideje nagyon rövid, lebontásukért a poli(ADP-ribóz) glikohidroláz (PARG) felel. A poli-ADP-ribozilációnak kitüntetett szerepe van a genomi integritás fenntartásában, DNS hibajavításban, a sejthalál és egyes transzkripciós folyamatok szabályozásában. Vizsgálatainkban arra kerestünk választ vajon ez a dinamikus fehérjemódosítási folyamat szerepet játszik-e a csontdifferenciálódás szabályozásában. Korábban, a PARP-1 és PARG fehérjék stabil géncsendesítését lentivírus részecskékkel valósítottuk meg. A csendesítés hatékonyságát, mRNS szinten, kvantitív PCR-al is vizsgáltuk. Megfelelő antitest hiányában a fehérjék deplécióját funkció-kiesési vizsgálattal elemeztük immuncitokémiával és Western blot technikával. Hidrogén-peroxiddal kezelt sejtekben jelentős poli(ADP-ribóz) polimer képződést tapasztaltunk. A polimerek lebontása jelentős mértékben elhúzódott a PARG hiányos SaOS-2 sejtekben.A csontdifferenciálódási folyamatot 12 napon keresztül követtük nyomon aszkorbinsav-2-foszfáttal, D-vitaminnal és dexametazonnal kiegészített médium jelenlétében. A differenciálódás során vizsgáltuk az alkalikus foszfatáz aktivitásának változását valamint a kalcium depozíciót kvalitatív, Alizarin Red festési eljárással és kvantitatív kalcium kolorimetriás mérőmódszer segítségével.