A HER2-ellenes célzott antitest kezelések témakörében a klinikumban alkalmazott trastuzumab és pertuzumab kombinációjának előnyét vizsgáltuk HER2-pozitív daganatokban, szem előtt tartva a trastuzumab rezisztencia jelenségét, mely HER2-pozitív emlőrákok esetén 50%-nál is gyakoribb. A kombináció hatékonyságát hatásmechanizmusának vizsgálatával támasztottuk alá. Az antitestek közvetlen biológiai (jelátviteli) és az ADCC-t kiváltó hatásai között az elkülönítést a trastuzumab és pertuzumab egész antitestek, valamint F(ab’)2 fragmentumaik összehasonlító vizsgálatával végeztük. Az in vitro ADCC vizsgálatokhoz nem-radioaktív kísérleti módszert kerestünk. Vizsgáltuk a FDA és a CFSE felszabadulás mérésén, a CFSE és propidium jodid jelölésen, valamint a kaszpáz aktiváció kimutatásán alapuló áramlási citometriás módszereket, valamint az impedancia alapú sejtanalizátor alkalmazhatóságát. A legnagyobb dinamikus tartományt és az antitest dózis-hatásfüggvényének kvantitálását ez utóbbi biztosította, így letapadó célsejtek esetén az impedancia alapú sejtanalizátor módszert, szuszpenzióban növő célsejtek esetén a kaszpáz aktiválódás áramlási citometriás meghatározását javasoljuk az ADCC radioaktivitás- mentes in vitro mérésére. A teljes trastuzumab és pertuzumab antitestekből kiindulva pepszin-agarózos emésztéssel az F(ab’)2 rész sérülése nélkül távolítottuk el az Fc fragmentumot. In vitro a teljes és F(ab’)2 antitest kezelések a JIMT-1 sejtek növekedését nem csökkentették, az ismerten trastuzumab-érzékeny BT-474 sejtvonalnál a két antitest kombinációja az egyedi kezeléseknél nagyobb, de additív proliferációgátló hatást eredményezett teljes antitestek és F(ab’)2 fragmentumok esetén is. In vivo az F(ab’)2 fragmentumok nem, a teljes antitestek egymáshoz hasonló mértékben csökkentették a JIMT-1 xenograft növekedését. A teljes antitestek kombinációja fokozottan gátolta a tumor növekedést, mely korrelált a xenograftok ex vivo immunfluoreszcenciás jelölésével kimutatható fokozott NK-sejt penetrációval. In vitro ADCC kísérletekben a két antitest kombinációja nem-szaturáló koncentrációknál additív volt. Ezek alapján feltehető, hogy a jelenleg klinikumban engedélyezett maximális antitest dózisok in vivo nem telítik az ADCC-t. Emiatt a daganat felfedezése után mihamarabb célszerű mindkét antitestet a klinikai kipróbálások során meghatározott maximális tolerálható dózisában, kombinálva alkamazni. Mivel a keringő tumorsejtek kifejezetten érzékenyek az ADCC-re, a kombinált antitest terápiát még a primer daganat rezisztenciája esetén is célszerű folytatni a metasztázisok kialakulásának gátlására.

Focusing on anti-HER2 targeted antibody treatments, we examined the combination of trastuzumab and pertuzumab antibodies in the treatment of HER2-positive breast cancer. The phenomenon of trastuzumab resistance is of great importance due to its high, over 50% rate. In this work, we have demonstrated the superior efficacy of combination therapy and investigated its mechanism of action. To separately analyze antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) -based and direct biological effects of the antibodies, we performed comparative studies of the whole antibodies and its F(ab’)2 fragments. First, we aimed to find the most suitable nonradioactive method for quantitating in vitro ADCC against adherent cells. We compared FDA and CFSE release, propidium iodide uptake of the CFSE labeled cells, assays based on the detection of caspase activation in flow cytometry; and an impedance-based real-time cell adhesion test. The largest dynamic range and the quantitation of antibody dose-response were possible with the latter, and therefore used we recommend this technique as the best non-radioactive choice for ADCC of adherent target cells, However, we recommend flow cytometric detection of caspase activation in target cells that are in suspension. Next, we have produced intact functional F(ab’)2 fragments from both trastuzumab and pertuzumab by removing the Fc fragment using pepsin-agarose digestion. We have used these and the whole antibodies for in vitro and in vivo investigations. Neither the whole nor the F(ab’)2 antibodies decreased the proliferation of the in vitro trastuzumab-resistant JIMT-1 cells. The combination of both the whole or the F(ab’)2 antibodies showed an additive antiproliferative effect on the trastuzumab-sensitive BT-474 cells. The F(ab’)2 fragments did not decrease the growth of JIMT-1 xenografts in vivo, but the whole antibodies were equally efficient. Combination of the whole antibodies decreased the proliferation further, which effect correlated with the decreased penetration of NK cells into the tumor, showed by ex vivo immunofluorescent labeling. In vitro, the combination of the two antibodies showed additivityin ADCC, but only at non-saturating concentrations. Overall, we propose that the therapeutic antibody doses currently approved do not saturate ADCC in vivo. Thus it is advisable to use both antibodies at the maximal approved doses in combination as soon as possible after the diagnosis. As circulating tumor cells are pronouncedly sensitive to ADCC, combination therapy should be continued as metastasis prevention even when the primary tumor is resistant.