Gombafertőzések molekuláris diagnosztikájának optimalizálása

Fájlok
Dátum
Folyóirat címe
Folyóirat ISSN
Kötet címe (évfolyam száma)
Kiadó
Absztrakt

Az invazív gombafertőzések növekvő incidenciája mellett az újabban megjelenő fajok és a rezisztencia kialakulása is pontos és gyors diagnózist kíván. A magas mortalitás és a kezelési nehézségek ugyancsak indokolják a gombainfekciók korai kimutatását. A PCR technikák jól illeszthetők a diagnosztikai eljárások közé, mivel könnyen kivitelezhetők, valamint áruk csökkenő tendenciát mutat, továbbá gyors és szenzitív megoldást kínálnak. Egy szűrőtesztként alkalmazható, pánfungális PCR optimalizálásán dolgoztunk, melynek keretében két ITS (internal transcribed spacer) alapú és egy 18S rRNS-t kódoló szekvencia alapú primerpárt vizsgáltunk úgy, hogy a már meghatározott anellációs hőmérsékletre optimalizáltuk a primer és MgCl2 koncentrációkat. A vizsgálat során megfigyelhető volt, hogy a különböző gombafajok esetén elterő primer koncentrációk bizonyultak optimálisnak, ezzel szemben a MgCl2 koncentráció nem befolyásolta lényegesen a Ct értéket. Továbbá az ITS alapú, real-time PCR érzékenyebbnek bizonyult a 18S rDNS alapú end point PCR-hez képest. A real-time PCR-ek olvadási görbe analízise során a Tm-ek és az amplifikációs görbék alapján megállapítható volt, hogy az ITS primerpárokat alkalmazva a pánfungális PCR alkalmas lehet egyes genusok elkülönítésére, de pontos genus és fajszintű identifikálás csak szekvenálással lehetséges. Amennyiben az ITS PCR és szekvenálás nem vezetne eredményre, a jövőben a 18S rDNS reakcióelegy módosításával, tenyészetből optimalizálnánk a PCR-t, amelyet szekvenálással egészítenénk ki. Az invazív aspergillosis igazolására a laboratóriumban elérhető primereket alkalmaztuk A. flavus és A. fumigatus vérből történő kimutatására, egy nemzetközi közleményben közölt real-time PCR adaptálásával. A két primerpár közötti jelentős Tm különbség ellenére megpróbáltuk a javasolt reakció körülményeket, melyek az A. fumigatus esetében jelentősen csökkentették az érzékenységet. A vizsgálat további optimalizálást igényel.

Leírás
Kulcsszavak
gombafertőzések, molekuláris, PCR, immunszupprimált
Forrás