Kv1.3 feszültségfüggő ioncsatornák cisztein mutánsainak létrehozása

Dátum
Folyóirat címe
Folyóirat ISSN
Kötet címe (évfolyam száma)
Kiadó
Absztrakt

A Kv1.3 feszültségfüggő káliumcsatornán elvégzett mutagenezis célja olyan cisztein mutánsok létrehozása volt amely feszültség-zár fluorometria (VCF) technikával vizsgálható,illetve megfelelő információt nyújt a pórusformáló domén és a feszültség szenzor domén térbeli és működésbeli kapcsolatáról. A membránpotenciál változását az ioncsatorna S1-S4 alegységek által létrehozott feszültségszenzor doménje(VSD) érzékeli. Depolarizáció hatására a pozitív töltéseket hordozó S4 alegység elmozdul,e konformációváltozás pedig áttevődik a pórusformáló doménra (PD),így a csatorna aktivációs kapuja kinyit,megkezdődik a kálium ionok átáramlása. A VCF technika fontos információt szolgáltat a két domén közötti csatolásról,illetve az azt befolyásoló tényezőkről,mivel független jelek mérhetők a két doménről. Az ioncsatornába, pontosabban az S3-S4 szegmenseket összekötő hurokba mutagenezissel egy alfa-aminosavat,ciszteint helyeznek be majd a mutáns DNS-ről készített mRNS-t Xenopus laevis oocytákba injektálják,expresszáltatják, ezután reaktív fluorofórral inkubálják őket a feszültség zár fluorometriás kísérletek elvégzéséhez. Az cisztein aminosavat helyspecifikus mutagenezissel (QuikChange II Site-Direced Mutagenesis) hozzuk létre a megadott pozícióban. Ezzel a módszerrel gyorsan és hatékonyan tudunk mutációt létrehozni polimeráz láncreakció (PCR) segítségével. A mutációt tartalmazó DNS-t szuperkompetens baktériumokba transzformáljuk hősokkal; majd táptalajra való szélesztés után a felvett telepeket regenerálódni hagyjuk. A következő lépésben elvégezzük a miniprepalálást, mellyel kinyerjük a plazmid DNS-t további felhasználáshoz. Végül a DNS szekvenálás nyújt információt arról,hogy sikeresen megtörtént-e a cisztein mutáció.

Leírás
Kulcsszavak
ioncsatorna, VCF, mutagenezis
Forrás