α2-plazmin inhibitor ellenes monoklonális antitestek előállítása és karakterizálása
Absztrakt
Az α2-plazmin inhibitor (α2-PI) egy olyan szerin proteáz inhibitor, melynek fő feladata a plazmin gátlása stabil 1:1 arányú plazmin-antiplazmin komplex létrehozásával. Hatékony fibrinolízis gátlást akkor tud létrehozni, ha az aktivált FXIII-as faktor keresztköti a kialakuló fibrinhez. Proteolitikus hasítások eredményeként a keringésben négy izoformája fordul elő, melyek különböző funkcióval rendelkeznek, eltérő a FXIII általi keresztkötés sebessége, valamint a plazminogénhez való kötődés képessége. Munkánk egyik célja olyan antitestek előállítása volt, amelyek képesek megkülönböztetni egymástól a négy különböző α2-PI izoformát. Másik célként olyan antitest szelektálását tűztük ki, amely alkalmas lehet a plazma totál α2-PI meghatározására korábban kidolgozott szendvics ELISA módszerben használt poliklonális antitest kiváltására. A natív α2-PI-vel történő immunizálást követően monoklonális antitesteket állítottunk elő, amelyek α2-PI-vel és az α2-PI szintetikus úton előállított peptidjeivel történő reakcióját vizsgáltuk indirekt ELISA módszerrel. 11 hibridóma sejtfelülúszó adott pozitív reakciót. Ezen pozitív sejtkultúrák közül hetet sikerült megklónozni. A hét monoklonális antitestből kettő, csak a natív α2-PI-vel reagáló antitest, IgG1, öt, a peptidekkel is reagáló antitest, IgM izotípusúnak bizonyult. A két IgG1 izotípusú antitestet sejtfelülúszóból Protein G affinitás kromatográfiával tisztítottuk, valamint tormaperoxidáz enzimmel jelöltük. A két új antitestet a korábban kifejlesztett anti-totál α2-PI szendvics ELISA-ban alkalmazott 10/5A8C6 monoklonális és a GA2AP-AP poliklonális antitestekkel való különböző kombinációkban vizsgáltuk szendvics rendszerben. A 2B3F3 monoklonális antitest semmilyen kombinációban nem működött szendvics ELISA-ban, az 1A1A1 antitest mind a két korábban alkalmazott antitesttel párosítva adott reakciót, de a plazmában lévő teljes α2-PI-nak csak a 20-25%-át mutatta ki. A munkánk során előállított két IgG1 izotípusú antitest, az eredményeink alapján alkalmatlannak bizonyult a totál α2-PI meghatározására szolgáló új módszer kifejlesztésére, illetve a korábban kifejlesztett módszerben alkalmazott poliklonális antitest kiváltására. Azonban, sikerült öt olyan antitestet is előállítani, amelyek bár IgM izotípusúak, de az α2-PI szintetikus úton előállított peptidjeivel adott reakció alapján alkalmasak lehetnek a proteolitikus hasítás következtében kialakuló izoformák azonosítására. Ennek igazolására további vizsgálatokra van szükség.