A CXCL1 kemokin klónozása, expressziója és karakterizálása

Abstract

A CXC motívum kemokin ligand 1 (CXCL1), a CXC kemokin alcsaládhoz tartozó citokin, amely részt vesz számos gyulladásos folyamat kialakulásában és egyes tumorok progressziójában. Első célunk az volt, hogy megvizsgáljuk két anti-inflammatórikus, rákmegelőző tulajdonságokkal bíró szer, a bexarotene (Bex) és a carvedilol (Carv) hatását a CXCL1 kemokin expresszióját makrofágokban és tumor sejtekben. A CXCL1 génexpresszióját qPCR módszerrel vizsgáltuk kezeletlen, valamint LPS-sel aktivált THP-1 humán monocyta sejtekben. A THP-1 sejtek felülúszójával HCC1143 tripla negatív emlőrák sejteket kezeltünk, és az ily módon kezelt emlőtumor sejtekből is elvégeztük a qPCR mérést. A CXCL1 hatásának sejtszintű, in vitro vizsgálata céljából génexpressziós vektorba való klónozását tűztük ki célul. Első lépésként specifikus reverse primerrel készítettünk cDNS-t, majd azt klónozó primerekkel amplifikáltuk. Az előállított inzertet pJET1.2 klónozó vektorba ligáltuk, kompetens DH5α baktériumokba transzformáltuk, majd ampicillin szelekció után izoláltunk klónokat. A klónok szelekciója restrikciós enzimekkel, a klónozó primerekkel, majd az inzert szekvenciáján belül tapadó primerpárral futtatott PCR reakcióval történt. A klónozott gént kapilláris szekvenálással validáltuk. Végül az azonosított inzertet mCherry és EGFP expressziós vektorokba helyeztük át. További célkitűzésünk a CXCL1 erőltetett kifejezése az expressziós vektor segítségével, majd a fehérje parakrin és autokrin hatásainak vizsgálata nem transzformált, illetve malignus emlő epithél sejtekre.