Gaucher-fenotípusú neuronok celluláris membránjaiban megjelenő biofizikai eltérések karakterizálása

Abstract

A lizoszómális béta-glükocerebrozidáz (GBA) örökletes deficienciája által okozott Gaucher-kór patognómikus eltérése a szubsztrát glükozilceramid (GlcCer) felhalmozódása az intracelluláris organellumok membránjában és a sejtmembránban, amely révén ezen membránok biofizikai jellemzői jelentősen megváltozhatnak, hozzájárulva a betegség patomechanizmusához. A Gaucher-kórban leginkább érintett sejtek a makrofágok mellett a neuronok, amelyek funkcionális eltérései megfelelő modellrendszer hiányában még jórészt ismeretlenek. Bár a betegségben alapvető jelentőségük lehet az intracelluláris organellumok membránjaiban megjelenő változásoknak, ezek izolált élő sejtekben történő vizsgálata rendkívül nehéz. Kísérleteinkben célul tűztük ki egy új neuronális Gaucher-modellrendszer membránbiofizikai karakterizálását. A GBA-/- egerekből származó immortalizált kortikális neuronokból álló modell validálására megvizsgáltuk a sejtmembrán GlcCer mennyiségét áramlási citometriával, majd környezeti paraméterekre szenzitív fluorofórok (TMA-DPH – fluiditás, Laurdan – hidráció, PY3174 – lipid rendezettség, illetve di-8-ANEPPS és F66 – dipólpotenciál) spektrofluorimetriás, konfokális mikroszkópos és áramlási citométeres elemzésével jellemeztük a megjelenő eltéréseket kontroll GBA+/+ sejtekhez viszonyítva. A GBA-/- neuronokban szignifikánsan megnőtt a GlcCer mennyisége, amely a membránbiofizikai paraméterek jelentős eltéréseivel társult, ugyanis a GBA+/+ neuronokhoz képest szignifikánsan lecsökkent a membránok fluiditása, illetve hidrációja, valamint megnövekedett a lipid rendezettség és a membránhoz asszociált molekuláris dipólok rendeződéséből származó dipólpotenciál mértéke. Bár spektrofluorimetriával és elsősorban áramlási citometriával jól jellemezhetők voltak a sejtszintű eltérések, konfokális mikroszkópiával elkülöníthettük a sejtmembrán és az intracelluláris membránok változásait is. Emellett a kedvező spektrális tulajdonságokkal bíró F66 kombinálhatónak bizonyult különböző specifikus organellum markerekkel, így kvantitatív képanalízis során karakterizálni tudtuk ezen organellumok membránbiofizikai eltéréseit élő sejtekben. Kísérleteink során validáltuk a GBA-/- neuronális Gaucher-fenotípusú modellrendszerünket és leírtuk az abban megjelenő membránbiofizikai változásokat. A dipólpotenciálra szenzitív F66 és specifikus organellum markerek kombinált alkalmazásával emellett lehetővé vált az intracelluláris organellumok potenciális patofiziológiai relevanciával bíró eltéréseinek