Gyógyszerészeti Tudományok Doktori Iskola

Állandó link (URI) ehhez a gyűjteményhez

https://hdl.handle.net/2437/2312

Általános Orvostudományi Kar

Gyógyszerészeti Tudományok Doktori Iskola
(vezető: Dr. Tósaki Árpád)

Orvostudományi doktori tanács

D45

Doktori program:

  • Mikrobiológia
    (programvezető: Dr. Gergely Lajos)
  • Farmakológia
    (programvezető: Dr. Tósaki Árpád)

Böngészés

Gyógyszerészeti Tudományok Doktori Iskola Szerző szerinti böngészés "Általános Orvostudományi Kar::Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet"

Megjelenítve 1 - 2 (Összesen 2)
  • Bélyegkép
    TételSzabadon hozzáférhető
    Kiméra antigén receptorral (CAR) átprogramozott T sejtek optimalizálása szolid tumorok kezelésére: a molekuláris kölcsönhatások és a differenciálódás szabályozásának lehetséges szerepe
    (2024) Mezősi-Csaplár, Marianna; Vereb, György; Szöőr, Árpád; Csaplár, Marianna; Gyógyszertudományok Doktori Iskola; Általános Orvostudományi Kar::Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet
    A kiméra antigén receptorokkal (CAR) módosított T sejtek paradigmaváltást hoztak a kemoterápia-rezisztens limfómák kezelésében, szolid szervi daganatokkal szemben alkalmazva azonban hatékonyságuk elmaradt a várakozástól. Bár a CAR konstrukciók CD3z effektor alegysége mellé beépített CD28 vagy 41BB kostimulációs domének nagy mértékben fokozták a T sejt készítmények hosszú távú hatékonyságát, a korai tumorellenes aktivitásban betöltött szerepük egyelőre tisztázatlan. Munkánk első felében első (.z), második (CD28.z, 41BB.z) és harmadik (CD28.41BB.z) generációs CAR-ok alkalmazásával tanulmányoztuk a CD28 és 41BB kostimulációs domének hatását a CAR-ok sejtfelszíni szerveződésére, diffúziós kinetikájára, és a korai citolitikus jelátvitel hatékonyságára. Eredményeink szerint míg a .z és a CD28.z CAR-ok dimereket képeznek, és azok nagy kiterjedésű membrán klasztereket alkotnak, a 41BB t tartalmazó CAR-ok főleg oligomer formában vannak jelen, és kisméretű membrán klaszterekbe szerveződnek. A CAR-ok laterális diffúziós sebessége a CD3z domén membrán síkjától mért távolságával arányos növekedést mutatott. Az első tumorsejttel való találkozáskor mind a CD28.41BB.z rendkívül mobilis oligomerjei és azok kisméretű klaszterei, mind a .z CAR-ok előre összeszerelődött nagyméretű klaszterei hatékonyabb proximális jelátvitelt közvetítettek, mint a közepesen mobilis CD28.z és 41BB.z CAR-ok. Ugyanakkor egy napos távon a tumorellenes citolitikus aktivitás a CD28.41BB.z CAR esetén bizonyult a legalacsonyabbnak, míg a .z CAR T sejtek tumor eliminációs hatékonysága minden vizsgált konstrukció között a legjobb volt. Mindezek alapján a molekuláris szerkezet, a membránbeli szerveződés és a mobilitás kritikus paraméterei az optimális terápiás hatékonysággal rendelkező CAR-ok tervezésének a kostimulációs domének hosszú távú biológiai hatása mellett. Munkánk második felében a CAR T sejtek hosszú távú hatékonyságát vizsgáltuk, melyben igen jelentős szerepet játszik a sejttermék összetétele. A hematológiai megbetegedéseket célzó CAR T terápiák esetén megfigyelték, hogy a kevésbé differenciálódott, citotoxikus CD8+ T sejtben gazdag készítmények rendelkeznek a legkedvezőbb tumorellenes hatékonysággal. Eredményeink szerint azonban szolid tumor modellekben a jobban differenciált, effektor memória domináns CAR T sejttermékek erősebb in vitro citotoxicitással rendelkeznek és kevésbé merülnek ki hosszan tartó antigénstimuláció alatt, mint azok a sejtcsoportok, amelyek differenciációját az előállítási szakaszban korlátoztuk. Megfigyeltük továbbá, hogy a 41BB kostimuláció hatására, valamint a transzdukciót megelőző T sejt expanzió során alkalmazott RetroNectin stimuláció mellékhatásaként a CD8+ citotoxikus CAR T sejtek aránya jelentős növekedést mutatott. Preklinikai modellünkben demonstráltuk, hogy az effektor memória irányú differenciáció, és a kiegyensúlyozott CD4+/CD8+ arány kölcsönzi a legerőteljesebb expanziós és citolitikus hatékonyságot a HER2+ szolid tumorokat célzó CAR T sejteknek. Ez a felismerés azt a világos üzenetet közvetíti a klinikumnak, hogy CAR T sejtkészítmények előállításnak optimalizálása és az ideális fenotípusprofil meghatározása a kezelt tumor típusának és antigénprofiljának függvényében elengedhetetlen feltétele a sikeres klinikai kipróbálásnak.
  • Bélyegkép
    TételSzabadon hozzáférhető
    Pixelenkénti autofluoreszcencia korrigált FRET mérés és implementálása Pannoramic Confocal konfokális patológiai szkennerre
    (2024) Rebenku, István; Vereb, György; Gyógyszertudományok Doktori Iskola; Általános Orvostudományi Kar::Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet
    A digitális patológia gyors fejlődése lehetővé teszi szöveti szintű morfológiai felvételek készítését. Immunhisztokémiai jelölések alkalmazásával ezek a morfológiai jegyek egy vagy két molekula expressziós szintjével korreláltathatóak. Napjainkban a fluoreszcenciás patológiai szkennerek megjelenése és elterjedése zajlik, melyek lehetővé teszik több molekula azonos mintában történő, multiplex jelölésen alapúló vizsgálatát. A Pannoramic Confocal az első digitális patológiai szkenner, amely a hagyományos transzmissziós és fluoreszcenciás képalkotáson túl konfokalitást is biztosít. A szkennert a konfokális képalkotás, stabilitás, pontosság, linearitás és érzékenység szempontjából vizsgáltuk. A konfokális kép pontkiterjedési függvényét aszimmetrikusnak, de térben invariánsnak mértük; ennek alapján dekonvolúciós algoritmust implementáltunk a műszerhez. Az X-Y dimenzióban mért stabilitás és relokalizációs pontatlanság jóval a felbontási határ alatt volt. Az intenzitásválasz lineáris volt (R² ≥0,9996). A kalibrált mérések azt mutatták, hogy indirekt jelölés alkalmazásával sejtenként ≥ 2000 molekula jól detektálható és leképezhető. A megvilágítást vizsgálva azt találtuk, hogy a mikroszkóp megvilágítása aszimmetrikus és inhomogén. Ennek kiküszöbölésére bevezettünk egy korrekciós módszert, amely alkalmas kisebb területről és térben változatos mintákról készült felvételek megfelelő korrekciójára is, valamint megbízható kvantitatív eredményeket ad. Ennek alkalmazásával, ill. a mérési pontosság ismeretében a Pannoramic Confocal alkalmas lehet szövettani metszeteken molekuláris interakciók mérésére. A Förster rezonancia energiatranszfer (FRET) népszerű eszköz a molekuláris kölcsönhatások tanulmányozására, mivel a 1-10 nm-es tartományban igen érzékeny a távolságra. Az intenzitás alapú, spektrálisan korrigált FRET mérési módszer előnye, hogy háromdimenziós, valamint időfüggő mérésekre is alkalmas. Annak érdekében, hogy használható legyen magas autofluoreszcenciájú metszetek mikroszkópos mérése során pixelenkénti autofluoreszcencia korrekcióval, az áramlási citometriában használt sejtenkénti korrekciós algoritmust adaptáltuk. A kidolgozott pixelenkénti autofluoreszcencia korrekció javítja a mérések pontosságát és különösen alacsony szignál/autofluoreszcencia értékek, valamint térben változatos autofluoreszcenciájú minták esetében ajánlható. Az analízis elvégzésére írt Fiji/ImageJ plugin szabadon elérhető. A mérési eljárást a Pannoramic Confocal készülékkel is teszteltük, ahol a sejteken és fagyasztva metszett szöveten mért FRET hatásfokok a kontrollként használt LSM 880 lézerpásztázó mikroszkóppal mértekkel egyezést mutattak. Ez alapján a pixelenkénti autofluoreszcencia korrigált FRET mérés implementálásra került a Pannoramic Confocal digitális patológiai szkenner szoftverében, megteremtve a diagnosztikai célú FRET mérések metodológiai és instrumentális alapját.