Molekuláris Orvostudomány Doktori Iskola
Állandó link (URI) ehhez a gyűjteményhez
Általános Orvostudományi Kar
Molekuláris Orvostudomány Doktori Iskola
(vezető: Dr. Csernoch László)
Orvostudományi doktori tanács
D42
tudományág:
-elméleti orvostudományok
Doktori programok:
- Jelátviteli folyamatok sejt- és molekuláris biológiája
(programvezető: Dr. Virág László) - Membránbiofizikai kérdések és vizsgálómódszerek
(programvezető: Dr. Szöllősi János) - Élettan és neurobiológia
(programvezető: Dr. Csernoch László)
Böngészés
Molekuláris Orvostudomány Doktori Iskola Szerző szerinti böngészés "Általános Orvostudományi Kar::Molekuláris Medicina Kutató Központ"
Megjelenítve 1 - 2 (Összesen 2)
Találat egy oldalon
Rendezési lehetőségek
Tétel Szabadon hozzáférhető Innovátor és bioszimiláris bioterapeutikumok glikomikai analíziseBorza, Beáta; Guttman, András; Borza, Beáta; Molekuláris orvostudomány doktori iskola; Általános Orvostudományi Kar; Általános Orvostudományi Kar::Molekuláris Medicina Kutató KözpontA biológiai gyógyszerek, vagy más néven bioterápiás készítmények napjainkban egyre nagyobb teret hódítanak a gyógyszerpiacon. Ezek a készítmények a rekombináns fehérjék széles skáláját ölelik fel, úgy mint a különböző hormonok, vérkészítmények, növekedési faktorok, antitest alapú termékek, fúziós proteinek vagy rekombináns oltóanyagok. Számos olyan rekombináns fehérjealapú gyógyszer van jelenleg a piacon, melyek szabadalmai napjainkban lejárnak, megnyitva ezzel a lehetőséget a konkurens cégek számára, hogy kifejlesszék a saját változataikat, amelyeket biohasonlónak, vagy más néven bioszimilárisnak hívunk. A bioszimilárisok olyan másolatai a már jóváhagyott biológiai gyógyszereknek, amelyek átfogó, összehasonlító vizsgálatok alapján hasonlóságot mutatnak az eredetivel fizikai-kémiai tulajdonságaikban, hatékonyságukban és biztonságosságukbank az innovátor termékhez viszonyítva, de nem teljesen azonosak vele. Az eredeti vagy más néven innovátor és biosszimilárisa közötti különbségek abból adódnak, hogy bizonyos információk az eredeti termék gyártásával kapcsolatban nem hozzáférhetőek vagy hiányosak, ezért a gyártás egyes aspektusai eltérhetnek az innovátor gyártási technológiájához képest. Ennek okán előre meghatározott biohasonlósági kritériumok hivatottak foglalkozni olyan kérdésekkel, mint a kis eltérésekkel szembeni érzékenység, valamint a hasonlóság mértékének megállapítása. A legtöbb rekombináns fehérje készítmény (pl. monoklonális antitestek, fúziós fehérjék, stb.) beleértve a biohasonló gyógyszereket is, általában glikolizált. Ezért a glikoziláció egy kritikus minőségi attribútum, amely alighanem az egyik legnagyobb kihívást jelentő bioszimilaritást befolyásoló jellemző. A bioszimilárisok glikozilációja erősen befolyásolhatja a készítmény biológiai aktivitását, stabilitását, farmakokinetikai profilját, felezési idejét, effektor funkcióit és immunogenitását. A glikozilációnak kiemelt jelentősége van a monoklonális antitestek két fő effektor funkciójára, az antitest-függő sejt közvetített citotoxicitásra (ADCC) és a komplement függő citotoxicitásra (CDC) nézve. Munkám során először egy olyan ortogonális analitikai módszeren (CGE-LIF) alapuló mennyiségi kiértékelést fejlesztettem ki, amellyel bioterapeutikumok N-glikán profiljában található CQA relevanciával bíró cukorszerkezetek pontos mennyiségei könnyen meghatározhatók. Ennek bemutatására az adalimumabterápiás fehérjét használtam fel, melyhez különböző mennyiségben adtam Man5 cukorstandardot. Az elektrokinetikus injektálás paramétereinek kombinációjával definiált injektálási együttható és a csúcsterületek között nagy pontosságú (R2=0.9990) lineáris összefüggés mutatkozott. Ezenkívül vizsgáltam a koncentráció hatását a csúcs alatti területekre, melynél szintén nagyon akkurátus (R2=0.9995) exponenciális összefüggést kaptam. Mindezek alapján megállapítottam az adalimumab mintában lévő eredeti Man5 mennyiségét. A következő lépésben az etanercept nevű fúziós fehérje innovátor és bioszimiláris verziójának mennyiségi összehasonlítását végeztem el, melyhez a relatív csúcsterületeket használtam. Kezdetben exoglikozidázos emésztéssel azonosítottam az etanercepthez kapcsolódó N-glikánokat, majd meghatároztam az elválasztás hőmérsékleti optimumát. Ezután megállapítottam, hogy ugyan nincs minőségbeli eltérés a két N-glikozilációs mintázat között, azonban az egyes struktúrák eltérő mennyiségben vannak jelen. Továbbá, a glikoszimilaritási index elméleti megfontolási alapján összehasonlítottam a relatív csúcsterületeket a mennyiségi kiértékeléshez. A glikoszimilaritás kiértékelésénél az általánosan elfogadott ±20% toleranciaküszöböt alkalmaztam. A mindkét verzióban legnagyobb mértékben kifejeződő mag-fukozilált biantennáris glikán (FA2) CDC modulátori szereppel bír, amely nem képezi részét a hatásmódnak, azaz nem tekinthető glikoszimilaritási kritériumnak. A bioszimiláris profilján megfigyelhető az erősen galaktozilált cukorszerkezetek markáns jelenléte (+130 és +124%), viszont glikoszimilaritás szempontjából ezeknek sincs relevanciája. A monogalaktozilált és oligomannóz glikánok nagyon hasonló arányban vannak jelen az innovátorral összehasonlítva (+7 és +10%) (−13 és +19%). Végezetül, annak érdekében, hogy a kapilláris elektroforézisre kifejlesztett analitikai módszerek és kiértékelések nagy mintaszámra is alkalmazhatók legyenek a gyakorlatban, fukozilált biantennáris, afukozilált biantennáris, oligomannóz, valamint bi-, tri- és tertaantennáris α(2-3), illetve α(2-6) irányultságú sziálsavas glikánkönyvtárakat analizáltam multikapilláris elektroforézis készülékkel. Maltooligoszacharid létra és a GUcal szoftver segítségével új glükózegység adatbázist hoztam létre, melynek segítségével multikapilláris elektroforézis készülék alkalmazásával pontosabb kiértékelhetőség valósítható meg. Az adatbázis felállítása után a glikánkönyvtárakkal és maltooligoszacharid létrával együtt analizált terápiás antitestek (etanercept és adalimumab) N-glikánjait azonosítottam. A doktori munkám során megvalósított módszerfejlesztési stratégiával a CQA relevanciával bíró cukorstruktúrák gyors és egyszerű analízise valósítható meg, ahogy azt egy innovátor termék és bioszimilárisa esetén elvégeztem. A nagy mintaszámra történő alkalmazás kifejlesztése megnyitja a lehetőséget az ipari és klinikai laboratóriumok számára a glikozilációs mintázatok összevetését egy ortogonális módszer alkalmazásával.Tétel Szabadon hozzáférhető Kapilláris elektroforézis és tömegspektrometriás módszerek fejlesztése terápiás fehérjék, valamint N-kötött és szabad glikánok karakterizálásáraSárközy, Dániel; Guttman, András; Sárközy, Dániel; Molekuláris orvostudomány doktori iskola; Általános Orvostudományi Kar::Molekuláris Medicina Kutató KözpontA műszeres analitikai technikák rutinszerű alkalmazása az utóbbi években alapvető jelentőségűvé vált, amit a jelen biotechnológiai, élelmiszeripari és orvosi kutatások számának ugrásszerű növekedése, valamint a piacon megjelenő új gyógyszer hatóanyagokkal, élelmiszer összetevőkkel szemben támasztott szigorú minőségbiztosítási előírások megjelenése indokol, melyek új kihívások elé állították az analitikai és molekuláris biológiai tudományterületek képviselőit. Az újgenerációs biológiai készítményekre (akár nagy molekulájú terápiás antitestekről, akár kisebb molekulaméretű gyógyszerkészítményekről és étrend-kiegészítő komponensekről beszélünk) egy természetes szerkezeti változatosság jellemzi, mely által a termékek bizonyos fokú heterogenitást mutatnak. Ezen változatok karakterizálásának, illetve biztonságos alkalmazhatóságának és hatásosságának elérése érdekében felmerült az igény, hogy a vizsgált analitikai problémák megoldására a már ismert és elfogadott standard megközelítések mellett ortogonálisan alkalmazható módszerek szülessenek, valamint, hogy azok folyamatos fejlesztési és optimalizálási lépesekkel a mindennapi analitikai gyakorlatba beépíthetők legyenek. Az elérhető, analitikai tudományterületen íródott tananyagok és tudományos publikációk alapján ismeretes, hogy létezik egy olyan egyszerű, gyors és nagyfelbontású műszeres technika, mely kis mintaigényével, valamint páratlan hatékonyságával egyre nagyobb jelentőséggel bír az elválasztástechnika területén, megcélozva főként az ipari (pl. gyógyszer tisztaság vizsgálatok) és orvosdiagnosztikai (pl. biomarker azonosítás) feladatok ellátását, továbbá a klasszikus HPLC-alapú módszerek által nem, vagy csak nehezen megoldható analitikai problémák alternatív áthidalását. Ez a technika a kapilláris elektroforézis (CE), aminek előnyös tulajdonságait és biológiai molekulák analízisére történő alkalmazhatóságát számos kérdés övezi. Doktori munkám során ezért kitűzött célom volt, hogy a ma ismert, legnagyobb jelentőséggel bíró kapilláris gélelektroforetikus (CGE) módszereknek a biomolekulák két nagyobb csoportján (fehérjéken és oligoszacharidokon) történő alkalmazhatóságát bemutassam, valamint, hogy ismertessem azon alapvető módszerfejlesztési kritériumokat, melyek segítségével megválaszolhatók a vizsgált biológiai mintákat és azok CGE analízisét érintő reprodukálhatósággal és hatékonysággal kapcsolatos kérdések. Ezek mellett fontosnak tartom bemutatni azokat az elektroforetikus elválasztó közegeket, melyeket a kutatómunkám során vizsgált mintákra optimalizálva fejlesztettem ki, ugyanis ezek tették lehetővé számomra a különböző mintatípusok szerinti hatékonyabb analízist. Bizonyos fehérjék és szénhidrátok CGE technika általi vizsgálatához azonban nem csupán a megfelelő elválasztási alapelv és elválasztó közeg megtalálása szükséges, legalább ekkora relevanciával bír egy érzékeny detektálási mód kiválasztása is. A megfelelő detektor optimális esetben jól definiálható képet ad a vizsgálandó analitokról, melynek révén lehetővé teszi azok pontos kvalitatív és/vagy kvantitatív meghatározását. A klasszikus, ultraibolya abszorbancia (UV) alapú detektálási módszerek mellet napjainkban előnyt élveznek az indirekt elven működő (pl. fluoreszcencia alapú) detektálási módszerek, melyek derivatizált minták nagy érzékenységű észlelését és karakterizálását teszik lehetővé. Dolgozatomban ezért bizonyos jelölési reakción alapuló detektálási lehetőségekre is kitérek, valamint azon kapcsolt technikákat is érintem, melyek direkt módon valósítanak meg ugyancsak nagy érzékenységű és nagy felbontású strukturális információgyűjtést. Ezek közül az elektrospray ionizációs tömegspektrometriát (ESI-MS) ismertetem részletesebben, melyet a mai analitikai gyakorlatban általában a standardként elfogadott kromatográfiás kapcsolhatósága, valamint kis, és nagymolekulák pontos szerkezetazonosítási képességével jellemeznek. Az általam tanulmányozott koncepció ettől eltérően az ESI-MS technika CGE-vel való bonyolult, ám annál nagyobb potenciállal bíró összekapcsolásának lehetősége, melynek alkalmazhatósága elsődlegesen az elválasztó közegek összetevőinek függvényében változik. Ennek tudatában megfogalmazott célként egy a biotechnológiai ipar számára évek óta fennálló analitikai probléma (fehérjék méret szerinti elválasztását követő, ”on-line” szerkezetazonosítás) megoldását is kitűztem. Az új megközelítés lényege, hogy a klasszikus nátrium dodecilszulfát poliakrilamid lapgélelektroforézis (SDS-PAGE) technika analógjaként alkalmazható, gyorsabb és on-line detektálást lehetővé tévő SDS-kapilláris gélelektroforézist (SDS-CGE) tömegspektrometriás detektálással kapcsolva optimalizáljam, ezzel megalkotva egy olyan analitikai rendszer kombinációt, mellyel a fehérjék méret alapú elválasztását tömegspektrometria általi, egyértelmű strukturális azonosítás követheti. A fejlesztett elválasztó közegeket, módszereket és detektálási módokat munkám során elsődlegesen újgenerációs, fehérje alapú bioterapeutikumokon, valamint N-kötött és szabad (nem fehérjéhez kötött) oligoszacharidok karakterizálásán keresztül szemléltetem.