Molekuláris Orvostudomány Doktori Iskola
Állandó link (URI) ehhez a gyűjteményhez
Általános Orvostudományi Kar
Molekuláris Orvostudomány Doktori Iskola
(vezető: Dr. Csernoch László)
Orvostudományi doktori tanács
D42
tudományág:
-elméleti orvostudományok
Doktori programok:
- Jelátviteli folyamatok sejt- és molekuláris biológiája
(programvezető: Dr. Virág László) - Membránbiofizikai kérdések és vizsgálómódszerek
(programvezető: Dr. Szöllősi János) - Élettan és neurobiológia
(programvezető: Dr. Csernoch László)
Böngészés
Molekuláris Orvostudomány Doktori Iskola Megjelenés dátuma szerinti böngészés
Megjelenítve 1 - 20 (Összesen 260)
Találat egy oldalon
Rendezési lehetőségek
Tétel Szabadon hozzáférhető Structural Investigation of Transglutaminases(2006-12-15T12:47:18Z) Ambrus, Attila; Fésüs, László; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Általános Orvostudományi Kar -- Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet; Elméleti orvostudományok doktori iskolaThe structural basis of the Ca2+ effect on transglutaminases is poorly defined. Therefore, it was our intention to initiate 43Ca NMR, surface polarity analysis combined with multiple sequence alignment studies to obtain structural information about the Ca2+ binding properties of the Factor XIIIA2, TGase 2 and TGase 3 (each of human origin). Since Ca2+ is also implicated in the folding of TGase 2, refolding studies were also performed to elucidate the nature of these effects. We have constructed a new homology model of human TGase 2 on the basis of the highest resolution (2.1Ã…) X-ray structure of cellular FXIII zymogen available. Our structure is more accurate than all the previously published homology models of human TGase 2. We have performed surface polarity analysis on the high resolution structure of cellular FXIII zymogen and on our homology model of TGase 2. Results are combined with that of the multiple sequence alignment of TGases and in this manner we could identify probably all the potential Ca2+ binding sites on these molecules; their numbers are more than reported earlier. From the previously published three putative sites of TGase 2, two possess negativity on the surface but the third one does not. Interestingly, in the recently determined high affinity binding pocket of FXIII, only one amino acid shows considerable negative potential on the molecular surface. The potential Ca2+ binding sites of all TGases can be predicted using the results of this analysis. In accordance with the high number of negatively charged clusters in our surface polarity analysis, 43Ca NMR provided higher (but still millimolar) average dissociation constants titrating on a wide Ca2+ concentration scale than previous studies did by equilibrium dialysis in shorter ranges. These results suggest the existence of low affinity Ca2+ binding sites on both FXIII-A and TGase 2 in addition to the well-known high affinity ones. Increasing the salt concentration or activating with thrombin, FXIII-A2 partially lost its original Ca2+ affinity in contrast to previous results, which showed no effects. The NMR data suggests different mechanisms for the proteolytic and salt activation processes of FXIII. The NMR provided structural evidence for the GTP induced conformational changes of TGase 2 molecule diminishing all of its Ca2+ binding sites. The NMR data on the Ca2+ binding properties of the first analyzed TGase 3 are presented here; TGase 3 binds Ca2+ the most tightly which weakens after proteolytic activation. Structural investigation of TGases 42 The investigated TGases have very symmetric Ca2+ binding sites and no EF-hand motifs. The refolding of the recombinant TGase 2 molecule to its catalytically active form from inclusion bodies essentially needs the presence of a helper material with higher molecular mass, but only in the initiation phase. In natural conditions it is probably a chaperon, while in vitro, it could be e.g. PEG. Ca2+ and nucleotides are ascribed as effector molecules in the early phase of the tructural reconstitution of TGase 2; the most efficient condition if they are together in the refolding buffer. Two optimal concentrations of PEG (probably two different folding pathways) and a relatively long time scale (with two activity maxima) for the evolution of the final structure of TGase 2 were identified during its refolding. An optimized refolding procedure of the non-fused recombinant TGase 2 is reported.Tétel Szabadon hozzáférhető A vestibularis magok kapcsolatainak vizsgálata békában és patkányban(2006-12-15T13:07:34Z) Bácskai, Tímea; Matesz, Klára; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Általános Orvostudományi Kar -- Anatómiai, Szövet- és Fejlődéstani Intézet; Elméleti orvostudományok doktori iskolaKülönböző molekulatömegű festékek alkalmazásával kimutattuk, hogy békában a primer afferens vestibularis rostok dye-coupled kapcsolatban vannak a másodlagos vestibularis neuronokkal, valamint a kisagyi szemcsesejtekkel. Ezek a dye-coupled kapcsolatok gap junctionok jelenlétére utalnak. Pályakövetéses módszerek alkalmazásával feltérképeztük a béka nucleus vestibularis lateralisanak (NVL) antero-, és retrograd kapcsolatrendszereit. Kimutattuk a korábban ismeretlen diencephalikus kapcsolatot, mely reciprok jelleggel bír. Leírtuk a NVL kapcsolatát a különböző mesencephalikus központokkal, így a szemmozgató agyidegi magokkal, és a tegmentális magokkal. Leírtuk a nucleus fasciculus longitudinalis medialist békában. Kimutattuk, hogy vestibularis rendszer kiterjedt kapcsolatban áll a formatio reticularissal, ami alapján feltételezhető, hogy a béka formatio reticularisa fontos szerepet tölt be a vestibularis ingerület közvetítésében. Kimutattuk a vestibularis rendszer és a proprioceptív impulzusokat fogadó agyterületek közötti reciprok kapcsolatot. Megtaláltuk a leszálló rostok által kialakított vestibulospinalis pályákat, amelyek a gerincvelő valamennyi funiculusában követhetőek egészen a lumbalis szegmentumokig, valamint leírtuk a spinovestibularis pálya eredő sejtjeit. Patkány esetében valamennyi vestibularis mag anterograd kapcsolatrendszerét leírtuk központi idegrendszeri struktúrákkal. Ezek közül kiemelendő a NVS korábban nem ismert kapcsolata a gerincvelővel. Leírtuk a vestibularis magok és nucleus ruber korábban ugyancsak ismeretlen kapcsolatát, amely az elektronmikroszkópos vizsgálatok alapján gátlónak és döntően GABAergnek bizonyult. Ennek alapján feltételezhető, hogy a NVS képes módosítani a cortico-rubralis és cerebello-rubralis útvonalak aktivitását a nucleus ruber neuronjainak gátlásával. Az általunk alkalmazott jelölési technikák segítségével lehetővé vált a vestibularis magok és a formatio reticularis kapcsolatainak pontosabb és részletesebb leírása. Kimutattuk a NVL reciprok kapcsolatait a rhombencephalonnal, valamint a gerincvelővel, ami alátámasztja a korábbi élettani vizsgálatok eredményeit. Mivel vizsgálataink az alapkutatások körébe tartoznak közvetlen gyakorlati hasznosításról nem beszélhetünk. A vestibularis rendszer szerkezetének pontos feltérképezése, a meglévő adatok újakkal való kiegészítése hozzájárulhat ahhoz, hogy megismerjük a vestibularis károsodás tüneteinek kialakulásáért és az azt követő kompenzációs folyamatokért felelős történéseket.Tétel Szabadon hozzáférhető A humán T limfociták Kv1.3 csatornájának farmakológiai és sejtfelszíni topológiai vizsgálata(2006-12-19T09:56:34Z) Bagdány, Miklós; Panyi, György; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Általános Orvostudományi Kar -- Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet; Elméleti orvostudományok doktori iskolaKnowledge gathered about the voltage-gated K+ channel Kv1.3 in recent years indicates the essential role of this channel in T cell activation and the killing process of cytotoxic cells. It is therefore of utmost importance to understand the details of the physiological role of Kv1.3 in T cell signaling and the mutual interplay between the channel and other signaling molecules. The prospect of using Kv1.3 as a target for immunosuppressive drugs in therapy further emphasizes the importance of studies focusing on this channel. As channel blockers of high affinity and selectivity are valuable tools for studying ion channel function and, in addition, they may serve as starting points in the development of new immunosuppressive agents, the search for such compounds is always justified. We identified and characterized a new peptide blocker of the Kv1.3 channel and proved that anuroctoxin selectively blocks Kv1.3 with high affinity (Kd = 0.73 nM). Regarding T cell physiology, the most important factor in the pharmacological profile of anuroctoxin is its selectivity for Kv1.3 over IKCa1, the Ca2+-activated K+ channel of human T lymphocytes. Mechanism of Kv1.3 block by anuroctoxin is similar to the block of other scorpion toxins, anuroctoxin is classical pore blocker. Because of its high selectivity for Kv1.3 (anuroctoxin did not block either Kv1.x or Kv2.1 channels), anuroctoxin might be used in clinical practice as an effective immunosuppressive agent to block lymphocyte activation and proliferation in the future. It is generally accepted that functional potassium channels and control of the membrane potential are essential to mitogenic induction of lymphocytes via the regulation of cell volume and cell-mediated cytotoxicity. In our experiments we examined the spatial distribution and association of Kv1.3 and molecules essential in T cell signal transduction to draw conclusions about the role of Kv1.3 in T cell activation based on these molecular interactions. We demonstrated in Jurkat cells and CTLs that the Kv1.3 channel is raft associated and distribution of the channel is nonrandom. We demonstrated a significant domain-level colocalization of Kv1.3/FLAG and CD3 in the Jurkat cell membrane. We showed the enrichment of Kv1.3/FLAG in the immunological synapse formed by CTL-JY cells. We proved that the Kv1.3 channels enter the IS during its development and they undergo a dynamical rearrangement. In conclusion, the results of our studies gave great contribution to the understanding of Kv1.3 function and regulation by the identification of a new high affinity and specificity blocker and the characterization of the distribution of these channels in the plasma membrane of lymphocytes.Tétel Szabadon hozzáférhető Reaktív nitrogén intermedierek által indukált poli(ADP-ribóz) polimeráz és mátrix metalloproteináz aktiváció vizsgálata in vitro és in vivo(2006-12-19T10:14:25Z) Bai, Péter; Virág, László; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Általános Orvostudományi Kar -- Orvosi Vegytani Intézet; Elméleti orvostudományok doktori iskolaThe characterisation of the biological effects of reactive nitrogen intermediates (RNIs) is an ever-growing area in the field of free radical research. The best characterised RNI is peroxynitrite (ONOO-) formed in the reaction of superoxide and nitric-oxide. ONOO- is capable of nitrating tyrosil residues of proteins, and of breaking the strands of DNA. Enhanced ONOO- production have been detected under different oxidative stress associated pathological states. DNA strand breaks lead to the activation of poly(ADP-ribose) polymerase (PARP), resulting in oncosis due to collapse of the cellular energetic system. PARP inhibition switches oncosis to apoptosis. In our experiments, the cytotoxicity of nitroxyl was investigated. Nitroxyl treatment in thymocytes leads to DNA single strand breaks and mitochondrial dysfunction. Cytotoxicity was attenuated by PARP inhibition, which was accompanied with the switching of the markers of cell death from oncotic to apoptotic (DNA fragmentation, caspase-3 activation, phosphatidyl-serine exposure). Nitroxyl-induced cytotoxicity was partially dependent on PARP activation, however our experiments suggest the dominance of PARP-independent pathways. We have also investigated the possible role of RNIs and PARP inhibition in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Doxorubicin treatment lead to increased nitrotyrosine staining, indicative of peroxinitrite formation. Doxorubicin treatment lead to cardiac muscle cell death, as indicated by increased levels of marker enzymes as CK and LDH. Both PARP inhibition by PJ34 and RNI decomposition by FP15 prevented cardiotoxicity. As a possible novel pathway of cardiotoxicity we have described matrix metalloproteinase (MMP) activation in the heart after doxorubicine treatment. The induction of the newly described MMP was mediated by oxidants. Our results support the pathological significance of the RNI-DNA strand break-PARP activation-oncosis pathway in doxorubicin-induced cardiotoxicity. We also proposed the role of free radical activated MMPs in doxorubicin-induced cardiotoxicity.Tétel Szabadon hozzáférhető Oxidatív stressz hatása a poli(ADP-ribóz) metabolizmusra és a kalcium homeosztázisra humán keratinocita és egér makrofág sejtvonalakban(2006-12-19T10:29:14Z) Bakondi, Edina; Virág, László; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Általános Orvostudományi Kar -- Orvosi Vegytani Intézet; Elméleti orvostudományok doktori iskolaVarious diseases are characterized by oxidative stress, when overproduction of reactive oxygen- and nitrogen-centered intermediates (ROI, RNI) occurs. Reactive species such as peroxynitrite and hydrogen peroxide are capable of causing DNA breakage triggering the activation of the DNA nick sensor enzyme poly(ADP-ribose) polymerase (PARP-1). Activated PARP-1 cleaves NAD+ into nicotinamide and (ADP-ribose), then attaches ADP-ribose residues onto nuclear acceptor proteins, and synthesizes branching polymer chains. PARP-1 fulfills a great number of biological functions ranging from the regulation of DNA repair, chromatin structure, replication, transcription to facilitating telomere elongation. However, overactivation of PARP by ROI and RNI in inflammation, shock and reperfusion injury, leads to necrotic cell death mainly due to depletion of NAD+ and ATP. We have developed three applications: enzyme cytochemistry, enzyme histochemistry and cellular ELISA to detect the activation of poly(ADP-ribose) polymerase in oxidatively stressed cells. and tissues The assays are based on the use of biotinylated NAD+ as PARP substrate. Furthermore, we have investigated the role of poly(ADP-ribose) glycohydrolase (PARG), the main poly(ADP-ribose) catabolyzing enzyme in oxidative stress-induced cytotoxicity. We have found that inhibition of PARG by gallotannin (GT) provided significant cytoprotection to peroxynitrite/hydrogen peroxide treated HaCaT cells (decrease in LDH release, propidium iodide uptake and caspase-3 activation), inhibited depletion of cellular NAD+ pools and caused the accumulation of poly(ADP-ribose) and inhibition of cellular PARP activity. Moreover, we have investigated the possible role of intracellular Ca2+ mobilization and high cell density, in the regulation of sensitivity of HaCaT keratinocytes to oxidative stress-induced cytotoxicity. First we have demonstrated that peroxynitrite triggered an elevation in intracellular calcium levels. Treatment of cells with the cell permeable calcium chelator BAPTA-AM provided significant cytoprotection against peroxynitrite/hydrogen peroxide–induced cytotoxicity. We have also observed that differentiating confluent keratinocytes were highly resistant to oxidative stress. Our results support a crucial role of Ca2+ homeostasis, cell density and poly(ADP-ribose) metabolism in the regulation of oxidative stress-induced cytotoxicity.Tétel Szabadon hozzáférhető Epigenetic Regulation of Hormonal Response(2006-12-19T13:49:00Z) Bálint, Bálint László; Nagy, László; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Általános Orvostudományi Kar -- Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet; Elméleti orvostudományok doktori iskola; Elméleti orvostudományok doktori iskolaIn order to study the epigenetic components of enhanced retinoid responsiveness we performed an in depth epigenetic characterization of the events taking place on the promoter of a retinoid regulated gene, tissue transglutaminase type 2. As a result of our studies, we propose a new model for the epigenetic regulation of retinoid response and differentiation competence in myeloid leukemia cells. We found that H4R3 methylation, a modification identified previously but withouta well defined biological role, is a hallmark of the primed cell state and precedes gene activation. This modification represents a transcriptional silent (unproductive), but primed state that marks key histones and makes them better substrates for receptor bound acetyltransferases (HAT-s). We propose that this mechanism accounts for the increased susceptibility of the cell to respond to a terminal differentiating agents, such as a retinoid, with increased gene expression and an increased potential for phenotypic differentiation. This model is consistent with the proposal that histone tail modifications function as the physical mediators of cellular memory. By providing docking sites for transcription factors and marking histones for subsequent covalent modifications, these methylation reactions serve as silent switches of gene expression. Our findings suggest an active and physiological role for arginine 3 methylation on H4 tails in retinoid response and provide a model amenable to further investigation and potentially to pharmacological exploitation. In order to further characterize the role of arginine methylation in signal integration and developmental processes we carried out mapping of the genomic loci marked by PRMT1 via histone H4 arginine 3 methylation. We used chromatin immunoprecipitation and cloning to isolate genomic loci marked by H4R3 methylation. After sequencing and in silico analysis we found that all of the genomic hits identified were intronic or at 5‘ end of specific genes. The locations identified were enriched in conserved transcription factor binding sites of POU2F1, MEF-2 and FOXL1 factors. A great number of the genes in the proximity of the identified genomic loci were involving signaling pathways and developmental processes.Tétel Szabadon hozzáférhető Molecular determinants of co-regulator binding and transcriptional activity of the retinoic acid receptor - retinoid X receptor heterodimer(2007-01-18T17:39:58Z) Benkő, Szilvia; Nagy, László; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Általános Orvostudományi Kar -- Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet; Elméleti orvostudományok doktori iskolaA génexpresszió szabályozásának transzkripciós kontrollja az élőlények megfelelő fejlődése szempontjából nélkülözhetetlen. A magreceptorokon és azok koregulátorain végzett biokémiai és szerkezeti vizsgálatok segítséget nyújtottak működésük mechanizmusának megértésében. A módszerekkel nyert információ világossá tette, hogy a magreceptorok megfelelő működése egy komplex, allosztérikus összhangot feltételez az LBD funkcionális doménjei között. Doktori munkám során azt a célt tűztük ki, hogy tanulmányozzuk az RAR és RXR molekulák koregulátor kötő képességét, a tényezőket melyek meghatározzák és befolyásolják működésüket, továbbá megkíséreltünk kapcsolatot találni a koregulátor kötés és a transzkripciós szabályozás között. Ezen munkák során lehetőségem volt számos modern molekuláris biológiai és biokémiai módszer elsajátítására és felhasználására. Ezen technikák segítségével meghatároztuk az RAR-LBD felszínén a korepresszor kötő területet. Összehasonlítva a korepresszor- és koaktivátor kötő felszínt megállapítottuk, hogy ezek átfedő régióban kötődnek egymáshoz. A koregulátor kötőhely mellet olyan oldalláncokat is azonosítottunk, melyek a H12 pozícionálásán keresztül befolyásolják a koregulátor kötődését. H12 deléciós mután RXR moolekulát használva azt találtuk, hogy az RXR csökkenti a partner receptor korepresszor kötését. Eredményeink továbbá azt is mutatják, hogy az RXR-H12 deléciója megváltoztatja a koregulátorkötő egyensúlyt és ez a partner receptor aktivitásának gyengítését eredményezi. Végeredményben azt mondhatjuk, hogy vizsgálataink hozzájárultak ahhoz az erősödő nézethez, miszerint a H12 pozíciója, dinamikája és stabilitása jelentős szerepet játszik magreceptorok transzkripciós aktivitásának szabályozásában. Eredményeink továbbá megegyeznek azokkal a korábbi eredményekkel, melyek bizonyítják a H12 szükségességét a transzaktivációban, a koaktivátor kötő felszín kialakításában, valamint a H12 delécióját ill. mutációját célzó kísérletek igazolják olyan domináns negatív receptor létrejöttét, mely fokozott korepresszor kötő képességel bír. Eredményeink bizonyítják, hogy a H12 aktív pozícióját befolyásoló oldalláncok szintén nagy mértékben hozzájárulnak a korepresszor és koaktivátor kötés egyensúlyának kialakításához. Ezek az eredmények a későbbiekben hozzájárulhatnak olyan mutáns receptorok tervezéséhez, melyek jóval szélesebb spektrumú aktiválásra képesek, mint amit korábban fetételeztek.Tétel Szabadon hozzáférhető Egy pleiotróp hatású autoregulátor molekuláris genetikai analízise Streptomyces griseusban(2007-01-18T18:06:34Z) Birkó, Zsuzsanna; Biró, Sándor; Elméleti orvostudományok doktori iskola; Hádáné Birkó, Zsuzsanna; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Általános Orvostudományi Kar -- Humángenetikai Intézet; Elméleti orvostudományok doktori iskolaAz Intézetünkben felfedezett C faktor az első tiszta formában előállított, Streptomycesekben azonosított fehérje természetű autoregulátor. A munka során a C faktort a bevezetésben taglalt szempontok szerint molekuláris genetikai módszerek alkalmazásával vizsgáltuk. Azonosítottuk a C faktor fehérje génjét, meghatároztuk szekvenciáját és a szekvenciából levezethető aminosav sorrendet. Az aminosav sorrend alapján nem igazolódott az a korábbi feltevés, hogy a C faktor cink-ujj típusú szabályozó fehérje. A komputeres analízist kiegészítve meghatároztuk a fehérje néhány, a szekvencia jelentős részét lefedő, triptikus fragmentjének aminosav sorrendjét is. A C faktor fehérje kiválasztásra kerül a sejtből, a 38 aminosavból álló szekréciós szignálszekvenciájában található twin-arginin motivum valószínűleg a Sec független Tat transzlokációs útvonalhoz irányítja, mely a Sec szekréciós úttól eltérően a fehérjéket harmadlagos illetve negyedleges szerkezetük kialakulása után és ezt megtartva választja ki a sejtből. Az érett fehérje valószínűleg rendelkezik egy transzmembrán régióval, amin keresztül képes a differenciálódás korai stádiumában lévő hifák membránjába integrálódni úgy, hogy N-terminális vége a sejt belső tere felé, míg C-terminális vége az extracelluláris tér felé mutat. A C faktor fehérje egyetlen eddig ismert és adatbankokban hozzáférhető fehérjével sem mutat szignifikáns homológiát. Előfordulása a Streptomyceseken belül nem általános, génjét illetve a vele nagyfokban homológ gént csak folyékony tápközegben jól spórázó törzsekben sikerült kimutatni. A fehérje termelése életciklus függő, az mRNS szintje a sporulációt megelőző stádiumban emelkedik meg. Meghatároztuk a transzkripciós start pontot, ami alapján megállapított -10-es és -35-ös promóter régió szekvencia homológiája szerint, a gén átírásában valószínűleg a σhrdB faktor játszik szerepet. A C faktor morfológiai differenciálódás szabályozásában betöltött szerepére vonatkozólag megállapítható, hogy szilárd táptalajon C faktort nem termelő S. griseus NRRLB-2682 kopasz mutánsában, különböző génekben történt defektus esetén is, légmicélium képzést indukál, illetve befolyásolja a sporuláció folyamatát. Folyékony tápközegben pedig, az ilyen körülmények között nem spórázó, C faktor génjét szintén nem tartalmazó S. griseus 52-1 teszt törzsünkben preconidium képzésben játszik szerepet. A C faktor nagy valószínűséggel a légmicélium illetve spóra képzést érintő zavarok szupresszoraként működik közre, de még nem ismert, hogy mely regulációs kaszkád tagjaként. Annak érdekében, hogy a vele kölcsönható fehérjét, illetve fehérjéket azonosítani tudjuk létrehoztuk a C faktor C-terminálisan His-farkazott változatát, melyet nagyobb mennyiségben csak E. coli expressziós rendszerben tudtunk termeltetni. A S. griseus 52-1 törzsből egy 55 és egy 110 kD molekulatömegű a C faktorral feltehetően kölcsönható fehérjét sikerült azonosítani. Az antibiotikum szintézisre gyakorolt hatásáról megállapítható, hogyha a transzformálandó törzs eredetileg nem termel streptomycint, akkor a C faktor alacsony kópiaszámban fokozza az antibiotikum termelést, magas kópiaszámban hatása már nem ilyen egyértelmű. Abban az esetben, ha a transzformálandó törzs eredetileg termel streptomycint, a C faktor sem magas, sem alacsony kópiaszámban nem növeli a szintézis mértékét.Tétel Szabadon hozzáférhető C. elegans protein diszulfid izomeráz transzglutamináz aktivitásának vizsgálata(2007-01-18T18:13:04Z) Blaskó, Bernadett; Fésüs, László; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Általános Orvostudományi Kar -- Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet; Elméleti orvostudományok doktori iskola1.Sikeresen klónoztuk a C. elegans PDI-3 cDNS-ét egy indukálható, expressziós vektorba, melynek segítségével előállítottuk a rekombináns fehérjét (rPDI-3). 2.A rekombináns fehérje mind in vitro, mind in vivo kísérletekben aktívnak bizonyult. Az rPDI-3 diszulfid izomeráz aktivitását meghatároztuk, és bizonyítottuk, hogy képes komplementálni a dsbA- deficiens E. coli törzset. 3.A rekombináns fehérje transzglutamináz aktivitással rendelkezett, erről két független mérési módszerrel is megbizonyosodtunk. A transzglutamináz aktivitás csak 55 °C-on volt detektálható, 25 °C-on nem. Meggyőződtünk arról, hogy nem artefactumról van szó, a PDI valóban katalizálja az amin- transzfert a kazein és biotinált amin között, ezt dot blot kísérlettel is igazoltuk. A rekombináns PDI specifikus aktivitását is megmértük, azt a tengerimalac szöveti transzglutaminázával nagyságrendben összehasonlítható értéket adott. 4.Deléciós mutánsok segítségével sikerült lokalizálnunk, hogy a detektált transzglutamináz aktivitásért a fehérje tioredoxin doménje a felelős. 5.Hely-specifikus mutagenezissel kimutattuk, hogy a rekombináns PDI-3 TGáz aktivitása független a PDI katalitikus centrumában található cisztein oldalláncoktól. 6.A tioredoxin domén mutagenezise bebizonyította, hogy a transzamidációban a CGHC tioredoxin motívumban található második cisztein játszik kritikus szerepet. 7.A vizsgált E. coli és humán tioredoxin is transzglutamináz aktivitást mutatott. 8.Mivel tioredoxin doménban egyetlen hisztidin található, ezért megvizsgáltuk, hogy vajon szerepet játszik-e a transzamidációs reakcióban. A hisztidin oldallánc kémiai módosítása a TGáz aktivitás szinte teljes elvesztését eredményezte. Szekvencia összehasonlításokkal két konzerválódott Asp régiót találtunk mind a PDI-ben, mind a tioredoxinban. A PDI-ben, és Trx-ben lehetséges katalitikus triádokat azonosítottunk. Homológ modellezés segítségével megszerkesztettük a C. elegans PDI-3 a doménjának a szerkezetét. 9.Cirkuláris dikroizmus spektroszkópia segítségével kimutattuk, hogy mind a PDI, mind a Trx egy hőmérséklet-indukálta szerkezetváltozáson megy keresztül, ami szükséges feltétele a transzglutamináz reakció in vitro lejátszódásához.Tétel Szabadon hozzáférhető A Ca2+-érzékenyítő levosimendan és a myocardium gbs-adrenerg jelátviteli rendszere közötti interakciók(2007-01-18T18:19:52Z) Bódi, Annamária; Édes, István; Papp, Zoltán; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Általános Orvostudományi Kar -- Kardiológiai Intézet; Elméleti orvostudományok doktori iskola-Echocardiographias vizsgálatainkkal megállapítottuk, hogy altatott tengerimalacokon a levosimendan dózis-függő módon növelte a bal kamra kontraktilitását. Előzetes isoproterenol stimulálás azonban megszüntette a levosimendan pozitív inotrop hatását. -Langendorff-szerint perfundált szíveken a levosimendan szignifikánsan növelte a bal kamra kontraktilitására jellemző paramétert (+dP/dtmax). Előzetes isoproterenol stimulálást követően azonban a levosimedan hatása lényegesen csökkent. -Izolált hámozott cardiomyocytákon is vizsgáltuk a levosimendan Ca2+-érzékenyítő tulajdonságának és a troponin I foszforilációjának összefüggését. Ezen kísérleti körülmények között az értelmezhetőséget komplikáló hemodinamikai hatások (elő- utóterhelés változása, szívfrekvencia módosulása stb.) nélkül tanulmányozhatók a tengerimalacból izolált myofibrillum tulajdonságai. Eredményeink szerint a levosimendan dózis-függő módon növelte a myofibrillum Ca2+-érzékenységét. Ez a hatás elsősorban alacsonyabb Ca2+ koncentrációk esetében volt jól észlelhető. Ugyanakkor a myofibrillumok ATP jelenlétében történő PKA előkezelése (foszforilációs körülmények között) teljes mértékben felfüggesztette a Ca2+-érzékenyítést. -Egyéb vizsgálatok irodalmi adatai alapján akut szívelégtelenségben a levosimendan jó hatékonyságú és jól tolerálható szernek bizonyult. A LIDO tanulmányba beválogatott betegeink adatait külön elemezve arra utaló jeleket tapasztaltunk, hogy a krónikus β-blokkoló kezelés a levosimendan hatékonyságát (perctérfogat növekedése, pulmonalis kapillaris nyomás csökkenése) semmiképp sem rontja, esetleg javíthatja is. Feltételeztük, hogy a hatékonyság növekedése a troponin I bazális fozforilációjának csökkenésével függ össze. Részben ezen megfigyelésünk alapján, a LIDO tanulmányban az egész beteganyagra kiterjesztve részletesen megvizsgálták a β-blokkoló kezelés és a levosimendan hatékonyságának összefüggését és hasonló eredményre jutottak.Tétel Szabadon hozzáférhető Funkcionális fehérje-mikrodomének a T és B sejtek plazmamembránjában: szerepük az antigén-specifikus T sejt aktivációban és proliferációban(2007-01-18T18:40:41Z) Bodnár, Andrea; Damjanovich, Sándor; Matkó, János; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Általános Orvostudományi Kar -- Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet; Elméleti orvostudományok doktori iskolaMunkám célja az antigének bemutatásában kulcsszerepet játszó HLA I molekulák valamint a T sejtek antigén-specifikus stimulációt követő proliferációjában esszenciális IL-2 receptor sejtfelszíni szerveződésének kialakításában, fenntartásában és szabályozásában szerepet játszó tényezők feltárása volt. A különböző humán B illetve T limfóma sejteken végzett vizsgálataink eredményei a következők: (1) Fluoreszcencia rezonancia energiatranszfer méréseinkkel kimutattuk, hogy a plazmamembrán koleszterin szintje (a membrán mikrodomén struktúrája) szerepet játszik a HLA I molekulák oligomerizációjának szabályozásában humán B limfoblaszt sejteken. (2) Áramlási citometriás illetve pásztázó közeli mező mikroszkópiás méréseink szerint a szabad (β2-mikroglobulint nem tartalmazó) HLA I nehézláncok, illetve az intakt HLA I heterodimerek, legalábbis részben, azonos fehérjemintázatok kialakításában vesznek részt a JY sejtek felszínén. FRET méréseink alapján a sejtfelszínen elérhető β2- mikroglobulin szint – feltehetően a nehézlánc különböző megjelenési formái közötti egyensúly módosításán keresztül – fontos szerepet tölt be a HLA I oligomerizáció mértékének szabályozásában. (3) Allospecifikus citotoxikus T limfociták alkalmazásával kimutattuk, hogy az antigén prezentáló sejt felszínén elérhető β2-mikroglobulin szint – feltehetően a HLA I oligomerizáció mértékének módosításán keresztül (ld.előző pont) – fontos szerepet tölt be a T sejt aktiváció illetve effektor funkció hatékonyságának szabályozásában is. (4) T limfóma/leukémia eredetű sejteken végzett FRET méréseink több, az IL-2R komplex és a HLA molekulák részvételével kialakuló „konzervatív” asszociációs motívum jelenlétét tárták fel a vizsgált sejtek plazmamembránjában. Az IL-2Rα sejtspecifikus oligomerizációjának kivételével ezen asszociációs motívumok előfordulását sem a vizsgált T sejt típusa, sem az IL-2R citokin-kötése nem befolyásolta lényegesen. (5) Fizikai és biokémiai módszerek alkalmazásával kimutattuk, hogy a Kit225 K6 limfóma/leukémia eredetű T sejtek plazmamembránjában az IL-2Rα (CD25) részben a glikoszfingolipidben és koleszterinben gazdag membrándoménekben (lipid tutajokban) helyezkedik el. FRET méréseink szerint a lipid tutajok egysége több, az IL-2Rα részvételével kialakuló asszociációs mintázat stabilitásának feltétele. A lipid tutajok egységének megbontása csökkentette az IL-2 stimulációt követő jelátviteli lépések hatékonyságát, amely arra utal, hogy ezek a membrán Funkcionális fehérje-mikrodomének a T és B sejtek plazmamembránjában 59 mikrodomének kulcsszerepet játszanak a magas affinitású IL-2R komplex kialakulásában. Ezt az elképzelést a sejtek detergens rezisztens membránfrakciójának biokémiai analízise is alátámasztotta: az IL-2Rα lánca mellett a jelátvitelért felelős β és γc alegységeket is sikerült azonosítanunk a DRM frakcióban. (6) FRET és biokémiai vizsgálataink egyaránt arra utalnak, hogy a K6 sejteken található CD25 molekuláknak csak egy része koncentrálódik a lipid tutajokban: jelentős hányaduk a detergens szolubilis membránrégiókban található, ahol véletlenszerűen vagy pedig más (pl. a transzferrin receptort tartalmazó) membrán mikrodoménekhez kapcsolódva helyezkedhetnek el.Tétel Szabadon hozzáférhető A vanilloid receptor-1 (TRPV1) szerepe a humán szőrtüsző biológiai folyamatainak szabályozásában(2007-01-18T18:44:46Z) Bodó, Enikő; Bíró, Tamás; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Általános Orvostudományi Kar -- Élettani Intézet; Elméleti orvostudományok doktori iskolaMunkánk során a vanilloid receptor-1 (TRPV1) funkcionális szerepét elemeztük a humán bőr és szőrtüsző biológiai folyamataiban. Megállapítottuk, hogy a TRPV1 a humán bőr számos sejttípusában (epidermális keratinocyták és Langerhans-sejtek, dermális szenzoros neuronok, erek simaizma és az endothelium, dermális simaizomkötegek, hízósejtek, faggyúmirigyek és verejtékmirigyek epitheliuma) kifejeződik. A szőrtüszőkben szintén jelentős TRPV1 immunreaktivitást figyeltünk meg az ORS és IRS, illetve mártix keratinocytákon. Azonos expressziós mintázatot találtunk a tenyésztett anagén VI follikulusokban, ugyanakkor katagén szőrtüsző megemelkedett TRPV1 expressziót mutatott. Funkcionális kísérleteinkben megállapítottuk, hogy follikulus szervkultúrában a TRPV1 specifikus aktiválása az agonista kapszaicinnel a hajszál hossznövekedésének gátlását okozta. Bebizonyosodott az is, hogy ezen növekedés-gátlás együtt járt a follikulusok anagén-katagén transzformációjával, valamint a mátrix keratinocyták apoptózisának indukciójával és proliferációjának csökkenésével. Ezen jelenségeket ugyanakkor nem kísérte a differenciálódási programok beindulása, illetve a pigmentképzés megváltozása. Kimutattuk azt is, hogy a kapszaicin-kezelést követően megemelkedett a hajciklus negatív regulátorának, a TGFβ2 szintje. A tenyésztett ORS keratinocytákon megállapítottuk, hogy a TRPV1 aktiválása lecsökkentette a sejtek proliferációját, apoptózist indukált, de nem befolyásolta a differenciálódási markerek szintjét. Kimutattuk emellett, hogy a kapszaicin hatására megváltozott számos, a hajciklus szabályozásában résztvevő molekula mennyisége (a pozitív regulátorok szintje csökkent, míg a szőrnövekedést gátló faktorok expressziója emelkedett). Végezetül bebizonyosodott, hogy ezen celluláris hatások nagy valószínűséggel az [Ca2+]i TRPV1-függő növekedésén keresztül valósultak meg. Mindezen adataink a TRPV1 központi szerepére utalnak a humán szőrtüsző biológiai folyamatainak szabályozásában.Tétel Szabadon hozzáférhető A béta-laktamáz enzim szerepének és a béta-laktám antibiotikumok hatásának vizsgálata a Streptomyces griseus NRRL B-2682-es törzsben(2007-01-19T09:44:07Z) Bartalné Deák, Eleonóra; Penyige, András; Szabó, István; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Általános Orvostudományi Kar -- Humángenetikai Intézet; Elméleti orvostudományok doktori iskolaÚj lokalizációjú ß-laktamáz enzimet izoláltunk a Streptomyces griseus NRRL B-2682 törzsből, az enzimnek membránhoz kötött és extracelluláris formáját is kimutattuk. A két különböző enzimforma, biokémiai sajátságai alapján, feltehetően ugyanannak a fehérjének eltérően „processzált” formája. Az extracelluláris ß-laktamáz N-terminális szekvenciája egy másik S. griseus törzs D-aminopeptidáz enzimével mutat nagyfokú hasonlóságot. A ß-laktamáz enzim extracelluláris térbe történő szekréciója függ a törzs differenciálódási folyamatának stádiumától, hiszen a nem spórázó, spontán mutáns törzsekben (spo1-, spo2-, spo3-) csak a membránhoz kötött enzimforma mutatható ki. Ezzel összhangban, ha a vad típusú S. griseus spórázását meggátoljuk, a törzs nem választja ki a ß-laktamáz enzimet az extracelluláris térbe. A nem spórázó törzsben globomycin hatására felszabadul a membránból a ß-laktamáz enzim, így feltételezzük, hogy a II. típusú szignál-peptidáz enzim vesz részt az enzim „processzingjében „. A spórázásban gátolt körülmények között növő vad típusú S. griseus tenyészetében a peptidoglikán sejtfal fragmentek és sejtfal analógok, a sejtfal szintézisét gátló antibiotikumok (penicillin, ampicillin, cefalosporinok és a vancomycin) kiváltották a ß-laktamáz enzim szekrécióját, és ezzel párhuzamosan helyreállították a spórázást is folyadék és szilárd médiumon egyaránt. A peptidoglikán sejtfal bioszintézisét gátló, és a sejtfal autolízisét indukáló ß-laktám antibiotikumok hatását tanulmányoztuk a plazmamembrán elektrofiziológiai állapotára a Streptomyces griseus NRRL B-2682 törzsben. Egy fluoreszcens esszét alkalmazva a ΔΨ szenzitív DiOC6(3)-tal vizsgáltuk a S. griseus protoplasztjainak membránpotenciálját. Kimutattuk, hogy a ß-laktám antibiotikumok – penicillin G, ampicillin, cephaloridin, cefamandol és cefotaxim – koncentráció és életkorfüggő módon ΔΨ csökkenést, depolarizációt okoznak ebben a törzsben. A ß-laktám vegyületek inaktív komponenseinek, mint például penicillamin, 6-aminopenicillin-sav és a biológiailag inaktív hidrolizált származéknak, a penicilloesavnak nincs depolarizáló hatása a protoplasztok membránpotenciáljára. Bizonyítottuk, hogy a nem specifikus, kation-csatornaképző ionofór, a gramicidin D nemcsak a plazmamembránt depolarizálta, hanem a sejtfal lízisét is indukálta. Megfigyeléseink alapján feltételezzük, hogy a transzmembrán potenciál értékének megváltozása fontos lépés lehet a sejtfal autolízisénak triggerelésében a Streptomyces griseus törzsben.Tétel Szabadon hozzáférhető Alternations in myocardial function and contractile proteins during human heart failure(2007-03-07T10:45:47Z) Borbély, Attila; Papp, Zoltán; Velden, Jolanda van der; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Általános Orvostudományi Kar -- Kardiológiai Intézet -- Klinikai Fiziológiai Tanszék; Elméleti orvostudományok doktori iskolaIsometric force generation and its Ca2+-sensitivity were measured in single, permeabilized human ventricular myocytes and biochemical methods were employed to identify changes in myofilamentary proteins. In vitro administration of the reactive nitrogen species peroxynitrite decreased the maximal Ca2+-activated isometric force (Fmax) to zero in a concentration-dependent manner, and this was accompanied by a marked deterioration of the cross-striation pattern of the myocytes. However, there were no differences before and after the application of 50 µM peroxynitrite in the Ca2+-sensitivity of force production (pCa50), in the steepness of the Ca2+-force relation and in the actin-myosin turnover kinetics. Western immunoblots and subsequent immunoprecipitation assays identified a peroxynitrite-induced nitration of a major Z-line protein, α-actinin. These results suggest α-actinin as a novel target for peroxynitrite in the human myocardium. Heart failure with preserved left ventricular ejection fraction (referred to as diastolic heart failure - DHF) is currently diagnosed in as much as 49% of heart failure patients. Despite the increased recognition of DHF, its pathophysiology remains incompletely understood. Endomyocardial biopsies obtained in DHF patients were therefore analyzed for collagen volume fraction (CVF) and sarcomeric protein composition and compared to control biopsies. Cardiomyocytes of DHF patients developed similar total isometric force at maximal Ca2+ concentration than controls, but their resting tension (Fpassive) in the absence of Ca2+ was almost twice as high. Administration of protein kinase A (PKA) to DHF cardiomyocytes lowered Fpassive to control value. In addition Fpassive and CVF combined yielded significant correlations with in vivo measured hemodynamic indices. Together with CVF, Fpassive determined in-vivo diastolic LV dysfunction. Correction of this high Fpassive by PKA suggests that reduced phosphorylation of sarcomeric proteins is involved in DHF. These hypophosphorylated sarcomeric proteins could, together with extracellular matrix modification, be specific myocardial targets for drug therapy of DHF. Ca2+-sensitizers represent a new class of inotropic drugs. In our study an attempt was made to quantify the magnitude of the effects of two Ca2+-sensitizers (EMD 53998 and OR-1896) in cardiomyocytes from end-stage failing (NYHA IV) and non-failing donor hearts under control conditions (pH 7.2; no added inorganic phosphate (Pi)) and under mimicked ischaemic conditions (pH 6.5; 10 mM Pi). Fmax and Fpassive did not differ between the failing and non-failing myocytes, but pCa50 was significantly lower in the failing than in the non-failing myocytes (ΔpCa50=0.15). This difference in Ca2+-sensitivity, however, was abolished during mimicked ischaemia. EMD 53998 increased Fmax and Fpassive by approximately 15% of Fmax and greatly enhanced the Ca2+-sensitivity (ΔpCa50>0.25) of force production. OR-1896 did not affect Fmax and Fpassive, and provoked a small, but significant Ca2+-sensitization (ΔpCa500.1). All of these effects were comparable in the donor and failing myocytes, but, in contrast with OR-1896, EMD 53998 considerably diminished the difference in the Ca2+-sensitivities between the failing and non-failing myocytes. The action of Ca2+-sensitizers under mimicked ischaemic conditions was impaired to a similar degree in the donor and the failing myocytes. Our results indicate that the Ca2+-activation of the myofibrillar system is altered in end-stage human heart failure. This modulates the effects of Ca2+-sensitizers both under control and under mimicked ischaemic conditions. Taken together, the measurement of force generation in isolated cardiomyocytes in combination with biochemical assays to determine myocardial protein alterations are appropriate, reliable and valuable methods for the characterization of human heart failure.Tétel Szabadon hozzáférhető Agyaktiválásos PET-vizsgálatok protokolljának optimalizálása(2007-05-03T13:14:02Z) Emri Miklós; Márián Teréz; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Általános Orvostudományi Kar -- PET Centrum; Elméleti orvostudományok doktori iskolaTétel Szabadon hozzáférhető Kvantitatív radioizotópos keringésvizsgálatok(2007-05-04T12:51:32Z) Garai, Ildikó; Galuska, László; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Általános Orvostudományi Kar -- Nukleáris Medicina Tanszék; Elméleti orvostudományok doktori iskolaAzt tartják, hogy a kéz és az agy a "legemberibb" szervünk. Kéz nélkül nem váltunk volna emberré és a legkisebb agyi működés zavar is azonnal kihat emberi mivoltunkra. E két szerv vérellátási problémái igen gyakoriak, számos kórkép alapját képezik, ugyanakkor kevés olyan diagnosztikai módszer áll a mindennapi gyakorlatban rendelkezésünkre, amelyik minden szempontból megfelelő lenne. Tanulmányunkban ilyen módszerek kidolgozására és a mindennapi diagnosztikai gyakorlatba való bevezetésére tettünk kísérletet a bemutatott eredményekkel. Jelen munkám során három témakörben végzett vizsgálataim tapasztalatairól számolok be: 1.Kvantitatív agyi vérátfolyás rezerv vizsgálatok 99mTc-HMPAO-val aszimptomatikus nyaki verőérszűkületben 2.Statikus 99m-Tc-DTPA kéz perfúziós vizsgálat módszere és számszerűsítése a "hideg kezek" vizsgálatára. 3.Dinamikus 99m-Tc-HSA kézperfúziós vizsgálat módszertana, számszerűsítési lehetőségei a radiális artéria biztonságosabb kivételének megítélésére.Tétel Szabadon hozzáférhető A humán immundeficiencia vírus és egér leukémia vírus proteináz működési sajátságainak in vitro tanulmányozása(2007-05-04T15:37:32Z) Fehér, Anita; Tőzsér, József; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Általános Orvostudományi Kar -- Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet; Elméleti orvostudományok doktori iskolaDoktori munkám során lehetőségem nyílt két komoly gyakorlati jelentőséggel bíró retrovírus, a HIV-1 illetve az MuLV proteolitikus enzimének tanulmányozására. A HIV-1 proteinázzal történő vizsgálataimban az AIDS terápiában alkalmazott proteináz gátlószerekkel szemben kifejlődő rezisztencia jelenségét helyeztük a középpontba, és ezt tanulmányoztuk a különböző HIV-1 proteináz illetve Gag hasítási hely mutációk szempontjából. Az általánosan elfogadott elképzelés szerint az aktív centrumot érintő mutációk lerontják, az enzim egyéb régióiban lokalizálódó másodlagos mutációk viszont javítják a proteináz katalitikus hatékonyságát. Eredményeink ezzel részben egybehangzónak (V82S, V82A és L90M), de több esetben ellentmondónak mutatkoztak (I84V és M46L). Elvégeztük a két legnagyobb szekvencia-variabilitással jellemezhető és egyben legkisebb hatékonysággal processzálódó Gag hasítási hely (NC/p1 és p1/p6) eredeti illetve mutáns változatainak a vad típusú és mutáns enzimekkel történő átfogó vizsgálatát. Eredményeinkkel alátámasztottuk, hogy e két Gag hasítási szekvenciában a proteináz inhibitor kezelés hatására megjelenő változások kompenzációs mutációk, melyek ellensúlyozva az enzimaktivitás csökkenésével járó proteináz mutációkat hozzájárulhatnak a gyógyszerrezisztencia kialakulásához. Ugyanakkor kimutattuk, hogy a természetes szekvencia-polimorfizmus nem befolyásolja számottevő mértékben a két hasítási hely processzálhatóságát. A különböző szubsztrátok hasíthatósága kapcsán tapasztalt változások alapján az enzim és szubsztrát között kialakított van der Waals kölcsönhatások maximalizálása tekinthető a specificitás fő meghatározójának, a hasonló hatás kulcsfontosságú lehet az inhibitor-hatékonyságban is. A gyakorlati jelentősége ellenére (génterápiás felhasználás, HIV-1 proteináz elleni gyógyszerfejlesztés) is csak kevéssé ismert MuLV proteinázzal kapcsolatos vizsgálatainkhoz sikerült pMalc2 rendszerben klónoznunk és expresszáltatnunk a fehérjét. Kidolgoztunk egy három lépésből álló eljárást az enzim tisztítására, melynek alacsony hatékonyságán az eredeti konstrukció módosításával és egy újabb tisztítási stratégia kifejlesztésével tudtunk javítani. Az ennek kapcsán végzett kísérleteink által lehetőségünk nyílt a baktériumsejtben történő expresszió során bekövetkező fehérjedegradációs jelenség tanulmányozására is. A tisztított rekombináns enzimet a vírusból izolált formával öszehasonlítva a két enzim viselkedése hasonlónak bizonyult. A rekombináns MuLV-PR működésének a HIV-1 proteinázzal történő részletes összehasonlító vizsgálata során több szinten is rámutattunk azok eltérő sajátságaira. Spektroszkópiás mérés alkalmazásával a két enzim eltérő pH függését tapasztaltuk. A specificitásbeli különbségeket a megfelelő virális hasítási helyeket reprezentáló oligopeptid szubsztrátok mellett különböző hosszúságú MuLV Gag fehérjék szubsztrátként történő alkalmazása során is megfigyeltük. Ezek alapján az MuLV proteináz szélesebb szubsztrátspecificitású viszont szűkebb katalitikus tartománnyal jellemezhető enzimnek bizonyult a HIV-1 proteinázhoz képest. Eredményeink értékelése kapcsán rámutattunk az oligopeptid, fehérje és sejtszintű kísérletekben tapasztalható különbségekre is. Végezetül egy gátlási profilozásra kifejlesztett fluoreszcens módszer segítségével összehasonlítottuk a két enzim klinikai használatba került és más PR inhibitorokkal való gátolhatóságát is, melynek kapcsán az MuLV proteináz HIV-1 PR-hoz képest alacsonyabb érzékenységét figyelhettük meg az AIDS terápiában alkalmzott inhibitorokkal szemben.Tétel Szabadon hozzáférhető K+ csatornák vizsgálata natív és heterológ expressziós rendszerekben(2007-05-04T16:34:28Z) Hajdú, Péter Béla; Gáspár, Rezső; Panyi, György; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Általános Orvostudományi Kar -- Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet; Elméleti orvostudományok doktori iskola1. Kimutattuk, hogy a T limfociták domináns, feszültség vezérelt K+ csatornájának (Kv1.3) egyensúlyi és kinetikai paramétereit módosítja a plazmamembrán koleszterintartalmának változtatása. Az aktiváció és az inaktiváció is lelassul a koleszterin bevitel hatására, míg annak csökkentése biológiai relevanciával nem bír. Ezenfelül a koleszterinszint emelése az aktiváció kétfázisú viselkedését eredményezte. A javasolt modellünk szerint a sebességi állandók arányának változása miatt, egy ún. aktivált-zárt állapot megjelenése tehető felelőssé az aktiváció efféle megváltozásáért. Azonban további kísérletek szükségesek annak kiderítésére, vajon a Kv1.3 csatornák szubcelluláris kompartmenekben/raftokban találhatók-e meg. 2. A Pandinus imperator venomjából izolált Pi1 frakció eltér a klasszikusnak mondható toxinok struktúrától: négy diszulfid híd biztosítja stabilitását. Kimutattuk, hogy e család korábban vizsgált tagjaihoz viszonyítva (Pi2 és Pi3) a Pi1 toxin a legkevésbé hatékony gátlószere a Kv1.3 csatornának, de a negyedik diszulfid híd nem befolyásolja a kötődés affinitását. A kisebb gátlási hatékonyság oka 11. és a 35. pozícióban levő, a toxin-csatorna komplex kialakításában fontos szerepet játszó aminosavakban való eltérésnek tulajdonítható. 3. A mutagenezis eszközeivel élve két olyan cTBAK-1 fenotípust sikerült megalkotnunk, melyek hozzájárulnak a pórusszelektivitás mechanizmusának, valamint a csatorna-gátlószer kölcsönhatásnak a megértéséhez. Eddigi ismereteink szerint nem sikerült olyan vegyületet találni, amely valamely kétpórusú csatorna szelektivitását változtatná meg.Tétel Szabadon hozzáférhető A vestibularis rendszer centrális kapcsolatai és regenerációja(2007-05-04T16:45:37Z) Halasi, Gábor György; Matesz, Klára; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Általános Orvostudományi Kar -- Anatómiai, Szövet- és Fejlődéstani Intézet; Elméleti orvostudományok doktori iskolaJelen munka első részében a vestibularis rendszer kapcsolatait vizsgáltuk fény- és elektronmikroszkópos neuronális jelölési módszerekkel patkányban. Neurobiotin jelölés segítségével feltérképeztük a nucleus vestibularis descendens (NVD) antero- és retrográd kapcsolatait a központi idegrendszer struktúráival, megerősítve és kiegészítve a korábbi adatokat. Elsőként mutattuk ki a NVD kapcsolatát a nucleus ruberrel. A rhombencephalonban leírtuk a NVD kapcsolatait az azonos- és az ellenoldali vestibularis magokkal, az érző agytörzsi magokkal és a formatio reticularissal. A gerincvelő mindhárom funiculusában kimutattuk a leszálló rostokat. Leírtuk a mag korábban nem ismert retrográd kapcsolatát a rhombencephalon képleteivel. Phaseolus vulgaris leucoagglutinin (PHA-L) jelölés segítségével vizsgáltuk a nucleus vestibularis superior (NVS) szinaptikus kapcsolatait a nucleus n. oculomotorii-val és nucleus ruberrel. Az oculomotorius magban talált NVS eredetű, GABA pozitív terminálisok jelenléte alátámasztja a korábbi fiziológiai vizsgálatokban kimutatott gátló kapcsolatok jelenlétét. A nucleus ruber neuronjaival létesített hasonló kapcsolat azt jelenti, hogy a NVS a nucleus ruber neuronjainak gátlásával képes módosítani a cortico-rubralis és cerebello-rubralis útvonalak aktivitását. A munka második részében az extracellularis matrix (ECM) makromolekuláinak és egyik receptorának megoszlását tanulmányoztuk béka idegrendszerében és vizsgáltuk szerepüket a vestibularis regenerációban. Specifikus próba segítségével a hyaluronsavat (HA), immunhisztokémiai módszerrel a phosphacant, valamint az ECM receptoraként ismert dystrophin-glycoprotein komplex alkotói közül a dystrophint és a β-dystroglycant elsőként mutattuk ki a béka idegrendszerében és leírtuk a tenascin, a fibronektin és a laminin eloszlását. A nervus vestibularis átvágását követő regeneráció során a HA mintázat qualitatív és quantitatív változásait ismertettük. Eredményeink szerint a perifériás idegrendszerben a HA permisszív hatású a regenerációra, amit a HA reakció intenzitásának növekedése jelez a regenerálódó idegben, valamint a perifériás és a központi idegrendszer átmeneténél lévő tranzicionális zónában (TZ). Ezzel szemben a központi idegrendszerben a HA non-permisszív hatása valószínű, amire a vestibularis magokban, az idegsejtek körüli un. perineuronal net (PN) területén a HA reakció intenzitásának csökkenése utal a regeneráció kezdetén, a benövő rostok kapcsolatainak kialakulását elősegítendő. A laminin immunreakció intenzitásának növekedése a vestibularis regeneráció során a perifériás idegrendszerben illetve a TZ-ban, és megjelenése a központi idegrendszerben a korábbi vizsgálatokban kimutatott permisszív szerepét igazolja az idegi regenerációban.Tétel Szabadon hozzáférhető A glutation, a nitrozoglutation és a cisztein neuromodulátor és neurotranszmitter szerepe a központi idegrendszerben(2007-05-04T17:13:49Z) Hermann, András; Varga, Vince; DE -- Természettudományi Kar -- Állatanatómiai és Élettani Tanszék; Elméleti orvostudományok doktori iskolaKísérleteink alapján megállapítottuk, hogy az endogén GSNO kölcsönhat az ionotrop glutamátreceptorokkal. Igazoltuk, hogy a GSNO az NMDA- és a kainátreceptor-ligandumok hatásos leszorítószere, valamint az általuk létrehozott kötődésgátlás kompetitív jellegű. Eredményeinkből arra következtethetünk, hogy a GSNO a glutamátreceptorokkal kölcsönhatva közvetlenül befolyásolhatja azok működését. A belőle felszabaduló nitrozóniumion (NO+) és glutationil gyök által a receptorfehérjék nitrozilációját és glutatiolációját okozhatja, ami hosszú távú szabályozást eredményez. A nitrozoglutation és az ionotrop glutamátreceptorok kölcsönhatásának tanulmányozásával hozzájárultunk a GSNO neuromodulátor szerepének tisztázásához. Igazoltuk, hogy sertés szinaptikus plazmamembrán-preparátumban a GSH önálló kötőhellyel rendelkezik, amelynek egy alacsony és egy magas affinitású változatát különítettük el. Megállapítottuk, hogy a GSH ciszteinil-oldallánca elengedhetetlenül fontos a molekula saját kötőhelyéhez való kötődésében. Eredményeinkkel igazoltuk, hogy ezen kötőhelyek különböznek minden eddig ismert serkentő vagy gátló aminosaverg receptortól. A glutation ezeken a felismerőhelyeken keresztül mint neurotranszmitter és neuromodulátor az idegi és a neurogliális intercelluláris kommunikációban is fontos szerepet játszhat. A szinaptikus plazmamembránok oldalláncainak kémiai módosításából kapott eredmények alapján feltételezzük, hogy a glutation a membrán diszulfidhídjaihoz és szabad SH-csoportjaihoz kötődik. A ligandum kötésében az arginil- és feltehetően a lizil-oldalláncok is részt vesznek. Ezen oldalláncok sókötések kialakítása révén stabilizálhatják a glutation és a membránfehérje kölcsönhatását. A glutamil- és az aszpartil-oldalláncoknak nincs szerepük a GSH kötődésében. A GSH specifikus receptorainak kimutatásával, valamint a receptor és a ligandum kölcsönhatásának tanulmányozásával nagymértékben hozzájárultunk a GSH neurotranszmitter szerepének tisztázásához. Kimutattuk, hogy a cisztein fokozza a glutamát és az NMDA-ligandumok által kiváltott Ca2+-felvételt neuronokba. Megszünteti az NMDA-receptorok feszültségfüggő Zn2+-blokkját. Az L-cisztein önmaga gyengén fokozza a Ca2+ intracelluláris szintjét, de hatványozottan erősíti a glutamát Ca2+-szint emelő hatását. A cisztein neurotoxikus hatását feltehetően az intracelluláris Ca2+-homeosztázis felborítása révén fejti ki a központi idegrendszerben. A cisztein NMDA-receptort módosító hatásának vizsgálatával hozzájárultunk a ciszteintoxicitás molekuláris hatásmechanizmusának tisztázásához.