Molekuláris Orvostudomány Doktori Iskola
Állandó link (URI) ehhez a gyűjteményhez
Általános Orvostudományi Kar
Molekuláris Orvostudomány Doktori Iskola
(vezető: Dr. Csernoch László)
Orvostudományi doktori tanács
D42
tudományág:
-elméleti orvostudományok
Doktori programok:
- Jelátviteli folyamatok sejt- és molekuláris biológiája
(programvezető: Dr. Virág László) - Membránbiofizikai kérdések és vizsgálómódszerek
(programvezető: Dr. Szöllősi János) - Élettan és neurobiológia
(programvezető: Dr. Csernoch László)
Böngészés
Molekuláris Orvostudomány Doktori Iskola Cím szerinti böngészés
Megjelenítve 1 - 20 (Összesen 260)
Találat egy oldalon
Rendezési lehetőségek
Tétel Szabadon hozzáférhető 18F-FDG Avid Léziók Textúra Analízise Humán PET/CT Vizsgálatok EsetébenForgács, Attila; Balkay, László; Forgács, Attila; Molekuláris orvostudomány doktori iskola; DE--Általános Orvostudományi Kar -- Orvosi Képalkotó Intézet, Nukleáris Medicina Nem Önálló TanszékA jelen képalkotó diagnosztika feladata és felelőssége, hogy a betegről készült felvételből a lehető legtöbb információt kinyerje annak reményében, hogy ezen információk segítenek a megfelelő terápia kiválasztásában, esetleg a terápia hatásának nyomon követésében. Ehhez illeszkedik az a törekvés is, hogy PET/CT vizsgálatok esetén, a képen megjelenő tumor vagy lézió mintázatát is jellemezzük. A mintázat jellemzésére számos mennyiség áll rendelkezésre, amelyek prognosztikai értéke az ezzel a területtel foglalkozó kutatók fő kérdése. A doktori értekezés alapvetően egy kísérletes munkát mutat be, amely úgynevezett fantommérések alapján igyekszik vizsgálni a mintázat elemzés metodológiai kérdéseit. A mérések tervezése és kivitelezése során igyekeztünk olyan kísérleti elrendezést megvalósítani, amely lehetővé teszi, hogy eredményeink relevánsak maradjanak a humán vizsgálatok esetében is.Tétel Szabadon hozzáférhető 3D nyomtatott fantomok vizsgálata és alkalmazása az orvosi képalkotó diagnosztikábanKiss, János; Balkay, László; Kiss, János; Molekuláris orvostudomány doktori iskola; Általános Orvostudományi Kar::Orvosi Képalkotó IntézetAz orvosi képalkotó eszközök mellett alkalmazott fizikai fantomok lehetővé teszik az egyes modalitások képalkotó képességeinek átfogó analízisét, illetve azok speciális kalibrálását. Ezen felül igen előnyösen alkalmazhatók új képalkotási technikák és algoritmusok kifejlesztésében és tesztelésében anélkül, hogy valódi pácienseket kellene bevonni a folyamatokba. Felhasználásuk kifejezett előnye, hogy azonos feltételek mellett ismételhető és összehasonlítható vizsgálatokat tesznek lehetővé. A 3D nyomtatás komplex és célorientált termékeket előállítani képes, relatíve alacsony üzemeltetési költségű, automatizált, additív gyártási megoldások összessége, mely technológia rohamos fejlődése és sokoldalúsága az orvosi képalkotás területén is új lehetőségeket teremtett. Az elmúlt években számos közlemény taglalta, hogy bizonyos képalkotó modalitásoknál és konkrét diagnosztikus kérdések esetén a 3D nyomtatási technológiák megfelelő módszert nyújtanak fantomok hatékony tervezésére és előállítására. A nukleáris kardiológia területén számos olyan diagnosztikai kihívás mutatkozik, melyre a jelenleg elterjedt, egyszerűsített geometriával rendelkező fantomkonstrukciók használata mellett kidolgozott eljárások nem adnak hatékony megoldást, így e téren felmerült az igény, anatómiailag helyes, könnyen előállítható és hatékonyan alkalmazható képminőség fantomokra. A 3D nyomtatási technológia egyre inkább megjelenik az MR radiomika területén is. Ugyanakkor jelenleg igen kevés az ilyen fantomkonstrukciókról szóló közlemény, mivel a textúra számolásokhoz kifejezetten nehéz, mind időben, mind összetettségben elegendően heterogén fantomokat alkotni, illetve ezeket reprodukálható módon előállítani. Új, struktúrájukban heterogén, nyomtatott fantomok létrehozását éppen ez, a területen tapasztalható hiátus motiválja, hiszen a kvantitálható radiomikai kiértékelés különösen fontos az egyébként nem kvantitatív MR képalkotás esetén. Az értekezést megalapozó kutatások során specifikus, szálolvasztásos (FDM) 3D nyomtatási technológiával politejsav (PLA), valamint, polietilén tereftalát glikol (PETG) filament anyagból előállított, páciens adatokra épülő, antropomorf, valamint matematikai, absztrakt fantomok szélesebb körű alkalmazhatóságát elemeztük a nukleáris kardiológia, illetve az MRI képalkotás területén. Vizsgálataink egyik részében azt tanulmányoztuk, hogy a SPECT/CT diagnosztika kardiológiai alkalmazásához készíthető-e olyan nyomtatott, antropomorf szívfantom, amellyel hatékonyan analizálhatók az eljárás leképzési tulajdonságai. Tanulmányoztuk továbbá, két, eltérő típusú, absztrakt textúrával rendelkező, 3D printelt fantomkonstrukció MRI felvételei esetén a textúra analízis módszereit, azok eredményeit és megbízhatóságukat. Physical phantoms used alongside medical imaging devices allow comprehensive analysis of the imaging capabilities of each modality and their specific calibration. In addition, they can be used to great advantage in the development and testing of new imaging techniques and algorithms without the need to involve real patients in the process. A distinct advantage of their use is that they allow repeatable and comparable tests under the same conditions. 3D printing is a set of automated, additive manufacturing solutions capable of producing complex and purpose-driven products at relatively low operating costs, and the rapid development and versatility of this technology has created new opportunities in the field of medical imaging. In recent years, a number of publications have shown that for certain imaging modalities and specific diagnostic questions, 3D printing technologies offer a suitable method for the efficient design and fabrication of phantoms. In the field of nuclear cardiology, there are a number of diagnostic challenges that are not effectively addressed by the current procedures using simplified geometry phantom constructs, and the need for anatomically correct, easily produced and efficiently applied image quality phantoms has arisen. 3D printing technology is also increasingly emerging in the field of MR radiomics. However, there are currently very few publications on such phantom constructs, as it is particularly difficult to create phantoms that are sufficiently heterogeneous in both time and complexity for texture computations, and to produce them in a reproducible way. The creation of new, structurally heterogeneous, printed phantoms is motivated by this gap in the field, as quantifiable radiomic evaluation is particularly important for otherwise unquantifiable MR imaging. During the research underlying the dissertation, we analyzed the broader applicability of patient-specific anthropomorphic and mathematical abstract phantoms produced using specific fused deposition modeling (FDM) 3D printing technology with polylactic acid (PLA) and polyethylene terephthalate glycol (PETG) filament materials in the fields of nuclear cardiology and MRI imaging. In one part of our investigations, we explored whether a printed anthropomorphic heart phantom could be created for SPECT/CT diagnostic applications in cardiology to efficiently analyze the imaging characteristics of the procedure. Additionally, we examined the methods, results, and reliability of texture analysis for two different types of 3D printed phantom constructions with abstract textures in MRI images.Tétel Szabadon hozzáférhető A CBA és az ABT-333 emlős kamrai akciós potenciálra és az azt kialakító ionáramokra kifejtett hatásaiDienes, Csaba Bálint; Szentandrássy, Norbert; Molekuláris orvostudomány doktori iskola; Általános Orvostudományi Kar::Élettani IntézetA TRPM4 a tranziens receptor potenciál csatornacsalád melasztatin alcsaládjának tagja. Expresszióját több humán szervben is kimutatták már. Részt vesz többek közt a membránpotenciál és a Ca2+ homeosztázis szabályozásában ingerlékeny, valamint nem ingerlékeny szövetek sejtjeiben egyaránt. A TRPM4-csatornák a szívben mind a munkaizomrostokban, mind pedig az ingerületvezető rendszerben kimutathatók, mutációjuk ingerületvezetési zavarokat okozhat, továbbá feltételezik, hogy a TRPM4 részt vesz a szívizom hipertrófia, valamint ischaemia-reperfúziós sérülés kialakulásában. Célunk volt megvizsgálni a TRPM4 ioncsatorna expresszióját kutyaszíven valamint egy célzottan a TRPM4-csatorna gátlására kifejlesztett szer, a CBA bal kamrai kutya szívizomsejtekre gyakorolt hatásait feltérképezni. A TRPM4 fehérje kifejeződését elsőként mutattuk ki kutyaszív mind a négy üregének falában, valamint a bal karma falából izolált kardiomiocitákban is. Megállapítottuk, hogy a CBA csökkentette az 1. fázis repolarizáció meredekségét, valamint enyhén növelte az akciós potenciál (AP) amplitúdóját, mely hatásokért valószínűleg a szer tranziens kifelé irányuló káliumáram (Ito) gátló hatása felelős. Az AP rövidülésének tendenciáját az AP feszültség-zár méréseken is látható, plató fázis alatti befelé irányuló áramok, különös tekintettel a késői nátriumáram CBA általi gátlása hozza létre. Eredményeink alapján tehát a CBA nem teljesen szelektív a TRPM4-csatornákra, így a csatorna funkcionális vizsgálatára önmagában natív szöveten nem használható, farmakológiai kombinációban való alkalmazása pedig fokozott körültekintést igényel. A késői egyenirányító káliumáram gyors komponense (IKr) a kamrai izomsejtek 3. fázis repolarizációjában elsődleges szerepet játszik. A csökkent IKr áram hosszú QT-szindrómához és korai utódepolarizációhoz (EAD) vezet, ezért potenciálisan életveszélyes ritmuszavarokat és hirtelen szívhalált okozhat. Az IKr több szelektív gátlószere is ismert, mint például a dofetilid vagy az E-4031. Ezen két vegyület közös tulajdonsága, hogy jelentősen megnövelik a kamrai AP időtartamát és metánszulfonamid csoportot tartalmaznak. Az ABT-333 (dasabuvir) egy hepatitis C fertőzés kezelésében használt vírusellenes szer, amely hasonlóan az IKr kialakításáért felelős hERG-csatornák egyes gátlószereihez (dofetilid és E-4031), szintén tartalmaz metánszulfonamid csoportot. Ezen hasonlóság alapján az ABT-333 is potenciálisan IKr gátló hatással bír, azonban a vegyület kamrai szívizomzatra gyakorolt hatásai még nem ismertek. Az ABT-333 kutya bal kamrai szívizomsejtek AP morfológiára, az AP-t kialakító ionáramokra, valamint expresszált hERG csatornákra gyakorolt hatásainak vizsgálatát tűztük ki célul. 1 μM ABT-333 reverzibilis módon megnyújtotta az AP-t, a 0. és 1. fázis maximális sebessége pedig irreverzibilis csökkenést mutatott. A magasabb ABT-333 koncentrációk nagyobb AP megnyúlást, a korai platópotenciál növekedését és a 0., 1. és 3. fázis maximális sebességének csökkenését okozták. Egyes sejtekben 3-30 μM ABT-333 koncentrációban EAD-k jelentek meg. Az AP feszültség-zár technikával mért 10 μM ABT-333-érzékeny áram egy IKr-nek megfeleltethető késői kifelé irányuló komponenst, valamint egy Ito-nak megfeleltethető korai kifelé irányuló komponenst tartalmazott. Az ABT-333 koncentrációfüggő, részben reverzibilis módon csökkentette a hERG-csatorna által közvetített ionáramot, 3,2 μM-os félgátló koncentrációval. Az ABT-333 a molekuláris szerkezete alapján potenciálisan blokkolja a hERG-csatornákat és az IKr áramot. Ez beigazolódott, mivel 1-30 µM ABT-333 jelenlétében a szív AP megnyúlt és EAD-k jelentkeztek, továbbá csökkent az expresszált hERG csatornák árama is. Az ABT-333 szívritmuszavarok szempontjából biztonságosnak tekinthető, mivel plazmaszintje még túladagolás esetén sem ér el ilyen magas koncentrációt.Tétel Szabadon hozzáférhető A citoszkeletális szeptin7 fehérje szerepe a vázizmok működésében és regenerációjábanSzabó, László; Dienes, Beatrix; Szabó, László; Molekuláris orvostudomány doktori iskola; Általános Orvostudományi Kar::Élettani IntézetA szeptin filamentumok a vázizomzat citoszkeletonjának szerves és nélkülözhetetlen részét képezik. Eddigi ismereteink alapján már tudjuk, hogy kölcsönhatásba léphetnek a sejtváz más elemeivel, a sejtmembránnal és emellett számos jelátviteli útvonalban is részt vehetnek. A szeptin7 egyedi szerkezete miatt nélkülözhetetlen a szeptin rendszert alkotó kompexek felépüléséhez. A szeptin7 citoszkeletális fehérjével végzett vizsgálatok során a genetikailag módosított egereken megfigyelt izomerő-csökkenés és gerincdeformitás a fehérje vázizomban betöltött jelentős szerepére utal. Ez a hatás kettős természetű. A szeptin rendszer strukturális feladatának elégtelensége mellett a mitokondriális funkció is sérült. Az egyes mitokondriumok szerkezeti módosulása és az összefüggő mitokondriális hálózatok kialakulása arra utalhatnak, hogy a szeptinrendszer és a mitokondriális osztódás, valamint hasítás folyamata szoros kapcsolatban áll. Ezek a morfológiai változások hozzájárulhattak a rostszerkezet további átrendeződéséhez és a mitokondriális funkció romlásához. A szeptin7 kifejeződése korfüggést mutatott, melyben a fiatal egyedekben a szeptin7 emelkedett expressziója a sejtosztódásban játszott fontos szerepének tulajdonítható. A kor előrehaladtával expressziója csökken, feladata inkább a membránszerveződésben, a differenciálódásban, a sejt-sejt közötti kapcsolatok létrehozásában és a belső struktúra kialakításában nyilvánul meg. Ezen folyamatok mindegyike jelentős szereppel bír a regeneráció folyamatában, ennek köszönhetően a szeptin7 hiánya több ponton is akadályozhatja az izomgyógyulást. A kísérleteink során igazoltuk, hogy a szeptin7 hiányának következtében az izomgyógyulás markerei megváltozott expressziót mutattak, ami arra utalhat, hogy a regeneráció fázisai lelassultak és elhúzódott a gyógyulás. A szeptin7 szerepének pontosabb megértése és interakciós partnereinek feltárása elősegítheti az izomregeneráció és az izomerő generálás folyamatának teljesebb feltérképezését. Az így szerzett ismeretek hozzájárulhatnak az izomsorvadásos betegségek, illetve az időskori izomgyengeség elleni terápiák kidolgozásához, valamint a mikrogravitációban bekövetkező izomleépülés megelőzéséhez, így javítva az érintett páciensek életminőségét.Tétel Szabadon hozzáférhető A citoszkeletális Szeptin7 fehérje szerepének vizsgálata C2C12 sejtkultúrákonRáduly , Zsolt; Szentandrássyné Gönczi, Mónika; Ráduly, Zsolt; Molekuláris orvostudomány doktori iskola; Általános Orvostudományi KarA vázizomsérülések során a gyors regenerációnak kiemelt egészségügyi, szociális és gazdasági szerepe van. Az elmúlt 50 év kutatásai rávilágítottak a tényre, hogy az aktin, mikrotubulusok és az intermedier filamentumok mellett a szeptinek csoportja is kiemelkedő szereppel bír a citoszkeleton felépítésében és szabályozásában. A szeptinek egymással változatos módon képesek kölcsönhatásokat létrehozni, ezzel olyan hetero-oligomereket és makromolekuláris komplexeket képezve, melyek a sejtosztódás, differenciálódás, migráció, immunválaszok és áttétképződések folyamataiban szerepet játszhatnak. Jelen dolgozatban a Szeptin7 fehérje szerepe kerül ismertetésre in vitro, C2C12 sejteken mért adatok felhasználásával. Eredményeink alapján kijelenthetjük, hogy a különböző szeptin fehérjék a C2C12 sejtek különböző fejlődési állapotaiban eltérően fejeződnek ki. Bebizonyítottuk, hogy Szeptin7 nélkül a sejtek nem képesek osztódni és a Szeptin7 elengedhetetlen a miotubulusok képződéséhez. Kimutattuk, hogy a Szeptin7 a citoszkeleton szerves részeként hozzájárul a sejtalak meghatározásához a mioblasztokban. Méréseink alapján feltételezzük, hogy a Szeptin7 hatással van a sejtek mitokondriális rendszerére is. Bizonyítékot szolgáltattunk arra, hogy a Szeptin7 filamentumok átrendeződnek a mioblasztok migrációja során. A Szeptin7 expressziójának downregulációja a migráció paramétereinek megváltozását eredményezte. A Szeptin7 különleges szerepét a mioblasztok migrációjában a forklórfenuron (FCF) kezelés is igazolja. Az FCF dózisfüggő módon gátolja a C2C12 sejtek proliferációját és vélhetően az FCF kezelés hatására a szeptin filamentumok dinamikus átrendeződése is gátolt, ezáltal a migrációs paraméterek is megváltoztak. Összességében a Szeptin7 fehérje alapvető szerepet játszik a mioblasztok proliferációs, differenciációs és migrációs folyamataiban, melyek kulcsfontosságú események a funkcionális vázizomrostok fejlődési és regenerációs szakaszaiban. Rapid recovery from musculoskeletal injuries is a priority in health, social and economic terms. Research over the past 50 years has highlighted the fact that, in addition to actin, microtubules and intermediate filaments, septins play a prominent role in the assembly and regulation of the cytoskeleton. Septins can interact with each other in a variety of ways, forming hetero-oligomers and macromolecular complexes that may be involved in processes of cell division, differentiation, migration, immune responses and metastasis. In this thesis, the role of the Septin7 protein is described using in vitro data measured in C2C12 cells. Based on our results, we can state that septin proteins appear differently in the developmental stages of C2C12 cultures. We proved that cells cannot divide without Septin7 and that Septin7 is essential for the formation of myotubes. We have shown that the level of Septin7 contributes to the determination of cell shape and is an integral part of the cytoskeleton. Our measurements suggest that the level of Septin7 also affects the mitochondrial system of cells. We provide evidence that Septin7 filaments are rearranged during myoblast migration. Down-regulation of Septin7 expression resulted in altered migration parameters. Downregulation of Septin7 expression resulted in altered migration parameters. The specific role of Septin7 in the migration of myoblasts is also confirmed by FCF treatment. FCF inhibits C2C12 cell proliferation in a dose-dependent manner and presumably FCF treatment inhibits the dynamic rearrangement of septin filaments. Taken together, the Septin7 protein plays a fundamental role in the entirety of myoblast proliferation, differentiation, and migration processes, which are key events in the development and regeneration of functional skeletal muscle fibers.Tétel Szabadon hozzáférhető A DNS metiláció és a cirkadián óra szabályozó mechanizmusainak vizsgálata a porcfejlődés soránVágó, Judit; Zákány , Róza; Molekuláris orvostudomány doktori iskola; Debreceni Egyetem::Általános Orvostudományi Kar::Anatómiai, Szövet- és Fejlődéstani IntézetA mozgási szervrendszert érintő megbetegedések korunk társadalmának legégetőbb egészségügyi problémái közé tartoznak. A sérült porcszövet újjáépítésére irányuló potenciális kezelési eljárások közül igen népszerűnek számít a mezenchimális sejtek beültetése és porc irányú differenciáltatása. A megfelelő gyógymódok kialakításához nagy szükség van a mezenchimális sejtek és azok kondrogenikus differenciációjának molekuláris szintű kutatására. Értekezésem alapjául szolgáló kísérletekkel az in vitro porcdifferenciáció során fellépő epigenetikai módosulásokat, illetve a cirkadián óra működésével összefüggő szabályozási mechanizmusokat tanulmányoztuk. Kutatómunkánk első lépésében a DNS metiláció szerepét vizsgáltuk az in vitro porcfejlődés során. A Dnmt3a, Tet1, és Ogt DNS metiláció-asszociált gének a porc fejlettségi állapotától függően eltérő erősséggel expresszálódtak, melyek közül a Tet1 mutatta a legmagasabb expressziós növekedést. Az in vitro porcdifferenciáció késői stádiuma során alkalmazott 5-azacitidin kezelés serkentőleg hatott a Sox9 és Acan porcmarkerek génexpressziójára. Ez a metiláció gátlásának volt köszönhető, ugyanis a két markergén promóter régiói csökkent metiláltságot jeleztek. Kutatómunkánk második lépésében a cirkadián óra szerepét tanulmányoztuk az in vitro porcfejlődés során. A szérum-sokk alapú óraszinkronizáció szignifikánsan fokozta a porcspecifikus extracelluláris mátrix termelődését, illetve a SOX9, ACAN és COL2A1 porc markergének expresszióját. A szérum-sokkot követően a molekuláris cirkadián óra központi óragénjei szinkronizált expressziós mintázatot mutattak. Kimutattuk a pozitív szabályozó BMAL1 és a negatív szabályozó PER2/PER3/CRY1/CRY2 expressziós mintázatainak 8-óránként változó antifázisos oszcillációit. Igazoltuk, hogy a cirkadián óra összehangolt működésének longdaysin-nel való megzavarása negatív hatással bírt a porcképződésre. Ezzel alátámasztottuk, hogy a normál ritmikus cirkadián óraműködésnek kulcsfontosságú pozitív szabályozó szerepe van porc szöveti fejlődésében. Egyetemi doktori értekezésem fő célja összességében az volt, hogy a DNS metiláció, illetve a molekuláris óra működésének részletes elemzésével olyan új szabályozó molekulákat azonosítsak, amelyek a porcszövet differenciációja során jelentős szereppel bírhatnak, a jövőben pedig potenciális target fehérjeként szolgálhatnak a porcdefektusok terápiás eljárásainak megtervezésekor.Tétel Szabadon hozzáférhető A poli(ADP-ribóz) polimeráz enzimek szerepének karakterizálása pikkelysömörbenAntal, Dóra; Szántó, Magdolna; Molekuláris orvostudomány doktori iskola; Debreceni Egyetem::Általános Orvostudományi Kar::Orvosi Vegytani IntézetA PARP1 és a PARP2 az ADP-ribozilációt, a fehérjék poszttranszlációs módosításainak egyik típusát katalizáló enzimek családjába tartozik. Katalitikus funkciójuk elsődlegesen DNS törések hatására aktiválódik, és így a PARP1 és PARP2 sokáig csak a DNS-törések hibajavításában betöltött kulcsfontosságú szerepéről volt ismert. PARP aktivációt leírtak már számos Th2-mediált gyulladásos folyamatban, de a vizsgálatok főként a PARP1 szerepére koncentráltak, míg a PARP2 gyulladásban betöltött szerepéről kevés információval rendelkezünk. A psoriasis (pikkelysömör) az egyik leggyakoribb krónikus gyulladásos bőrbetegség, amelynek során a bőrön jellegzetes plakkok alakulnak ki az epidermális keratinociták túlzott mértékű proliferációjának és elégtelen differenciációjának következményeként. A jelenleg elfogadott magyarázat szerint a pikkelysömör kialakulásáért a Th sejtek bizonyos populációi, elsődlegesen a Th17 sejtek által mediált immunválaszok felelősekk, amelynek közvetítésében az IL23/IL17 citokin tengelynek központi szerepe van a psoriasis-ra jellemző gyulladás kialakulásában. Munkánk során a PARP1 és a PARP2 lehetséges szerepét kívántuk feltárni a psoriasis-ra jellemző gyulladás szabályozásában. Vizsgálatainkat mind psoriasisos betegek szövetmintáit felhasználva, mind egér modellek alkalmazásával, mind pedig sejtkultúrás kísérleteket használva valósítottuk meg. Eredményeink alapján úgy tűnik, hogy a PARP1 ellentétes szerepet tölthet be a Th17 típusú gyulladásban, például pikkelysömörben, mint a Th2-mediált folyamatokban, valamint feltételezzük, hogy a PARP2 expresszió és az epidermális keratinociták ösztrogén szintézise között összefüggés lehet, amely hozzájárulhat a lokális gyulladásos folyamatok szabályozásához a pikkelysömör patomechanizmusa során.Tétel Szabadon hozzáférhető A tranziens receptor potenciál vanilloid (TRPV)-3 ioncsatorna szerepe humán epidermális keratinociták gyulladásos folyamatainak szabályozásábanVasas, Nikolett; Bíró, Tamás; Vasas, Nikolett; Molekuláris orvostudomány doktori iskola; Debreceni Egyetem::Általános Orvostudományi Kar; Debreceni Egyetem::Általános Orvostudományi Kar::Élettani IntézetAz endocannabinoid rendszer (ECS) részét képező ionotróp receptorokon belül a tranziens receptor potenciál (TRP) csatornák vanilloid alcsaládjának több tagja azonosításra került a bőr számos alkotóelemén, többek között a tranziens receptor potenciál vanilloid (TRPV)-3 ioncsatorna is, melynek leggyakoribb előfordulása a humán bőrben van. Munkánk során a TRPV3 ioncsatorna vizsgálatát végeztük a bőr legkülső rétegét alkotó egészséges epidermális keratinocitákon, valamint az egyik leggyakoribb bőrbetegség, az atópiás dermatitiszes (AD) betegekből származó mintákon. Kutatásunk célja az volt, hogy megvizsgáljuk, hogy a TRPV3 ioncsatorna milyen mértékben expresszálódik az egészséges és AD-s keratinocitákban, funkcionálisan aktív formában van-e jelen és az aktivált csatorna szerepet játszik-e a bőr gyulladásos folyamatainak kialakulásában, fenntartásában. Kísérleteink első felében a tranziens receptor potenciál vanilloid-3 (TRPV3) ioncsatorna kifejeződését és gyulladásban betöltött szerepét vizsgáltuk. Kimutattuk a TRPV3 ioncsatorna expresszióját humán bőrben és primer epidermális keratinocita tenyészeten. Sikerrel igazoltuk, hogy a csatorna Ca2+-permeábilis ioncsatornaként funkcionál; carvacrollal, illetve 2-APB-vel történő aktivációja dózis-függő módon csökkenti az epidermális keratinociták proliferációját és apoptózis révén sejthalált indukál. Mindezen hatások TRPV3 specifikusnak mutatkoztak, mivel a folyamatok kivédhetőnek bizonyultak a TRPV3 specifikus géncsendesítés segítségével. A csatorna rövidtávú aktivációja erős proinflammatorikus választ vált ki, amiért vélhetően az NF-κB jelátviteli útvonal tehető felelőssé. Ezt követően meghatároztuk a TRPV3 molekuláris és funkcionális expresszióját AD-s betegek nem-lézionális bőrében, ami a terminális differenciálódás és bizonyos immunfunkciós rendellenességek tekintetében jelentősen eltér az egészséges bőrtől. Vizsgálataink során elsőként bizonyítottuk, hogy a TRPV3 teljes vastagságú bőrben, valamint epidermális szöveti mintákon jelentősen megemelkedett expressziót mutat a nem-lézionális humán AD-s epidermiszben, hasonlóan a lézionális AD mintákhoz. További jelentőséggel bír, hogy a TRPV3 funkcionálisan is aktívabb formában expresszálódik a nem-lézionális AD keratinocitákon az egészséges keratinocitákhoz képest, amit a szignifikánsan magasabb (agonistával indukált) TRPV3-specifikus ionáramok igazolnak. Eredményeink rávilágítanak arra, hogy a TRPV3 kiemelkedő szerepet játszik a bőr gyulladásos folyamatainak szabályozásában, ezáltal potenciális terápiás célpont lehet gyulladásos bőrbetegségekben.Tétel Szabadon hozzáférhető A tranziens receptor potenciál vanilloid-4 ioncsatorna élettani és farmakológiai jelentőségének vizsgálata humán szőrtüszőnSzabó, Imre Lőrinc; Bíró, Tamás; Szabó, Imre Lőrinc; Molekuláris orvostudomány doktori iskola; Debreceni Egyetem::Általános Orvostudományi Kar::Élettani IntézetJelen vizsgálataink során az endokannabinoid rendszer szőrtüszőben betöltött élettani szabályozó szerepéről szóló ismereteinket kívántuk bővíteni és egy új TRP csatornáról bizonyítottuk be, hogy szerepe lehet a hajciklus szabályozásában. Eredményeink szerint a TRPV4 ioncsatorna kifejeződik humán szőrtüszőben, főként a külső gyökérhüvely rétegben, melyben a keratinocitákon a TRPV4 Ca2+-csatornaként funkcionál, és in vitro hőstimulussal is aktiválható. A TRPV4 kémiai stimulálása az keratinociták apoptózisához vezet, az intakt, humán szőrtüszők TRPV4 aktivációja pedig katagén fázist indukál, valamint gátolja a szőrnövekedést ex vivo. Továbbá vizsgálatuk a cannabidiol humán szőrtüszőkre kifejtett hatásait és az azok hátterében álló receptorokat. Megállapítottuk, hogy az alkalmazott CBD kezelésnek koncentrációtól függően eltérő, ellentétes hatásai vannak. Alacsony koncentrációban alkalmazva elhanyagolható módon befolyásolja a hajciklust, a szőrnövekedést is csak inszignifikáns módon fokozza. Ráadásul, ebben az alacsony koncentrációban alkalmazva adenozin receptor mediált anti-inflammatórikus hatást fejt ki. Magas koncentrációban alkalmazva azonban a CBD képes a TRPV4 csatornákat aktiválni, amely dominálja szőrtüszőn kifejtett hatásait; így a CBD gátolja a szőrnövekedést, a mátrix keratinociták proliferációját és katagén morfológiát indukál. A szőtüszőn a TRPV4-et leginkább kifejező külső gyökérhüvely keratinocitákon pedig apoptózis és nekrózis kialakulásához vezet a TRPV4 aktivációjával és Ca2+-beáramlással. Vizsgálataink amellett, hogy új információval szolgálnak az endokannabinoid-TRP rendszer, valamint a CBD hajbiológiai hatásairól, jól illeszkednek a korábban felhalmozott ismeretek közé. Eredményeink szerint a TRPV4 hozzájárulhat a TRPV1 és TRPV3, valamint a CB1 receptorok által a hajcikluson fenntartott pro-katagén „endokannabinoid-tónushoz”. Ezenfelül jellemeztük CBD összetett szőrbiológiai hatásait, és azonosítottuk az ezeket mediáló célpontokat, úgymint az külső gyökérhüvely keratinocitákon kifejeződő TRPV4 és adenozin receptorokat.Tétel Szabadon hozzáférhető A vázizom rianodin receptorának Ca2+-függő és gyógyszeres szabályozásaMagyar, Zsuzsanna Édua; Almássy, János; Molekuláris orvostudomány doktori iskola; Debreceni Egyetem::Általános Orvostudományi Kar::Élettani IntézetA megfelelő sejtműködés fenntartásához elengedhetetlen az intracelluláris kalciumion koncentráció ([Ca2+]IC) precíz szabályozása. A szabályozás fontos eleme a szarkoplazmás retikulum (SR) Ca2+ csatornája, a rianodin receptor (RyR), ami számos sejttípus [Ca2+]IC-nak a megemelésében szerepel. Fontosságát jól mutatja, hogy a RyR genetikai hiánya az élettel összeegyeztethetetlen, pontmutációi pedig olyan rendellenes csatornaműködést eredményeznek, amely szívritmuszavarokhoz, izomgyengeséghez, vagy éppen fokozott izomtónushoz, malignus hipertermia szindrómához (MHS) vezethetnek. Ezeket a kórképeket összefoglaló néven rianopátiáknak nevezzük. Munkánk során azt próbáljuk megérteni, hogy a RyR működését érintő, molekuláris szintű elváltozások hogyan függenek össze a vázizmokat és a szívet érintő tünetekkel, és hogy ezek a kóros folyamatok gyógyszeres terápiával hogyan fordíthatók vissza. Az irodalomban elfogadott tény, hogy ha a kardiomiociták SR Ca2-töltöttsége meghalad egy bizonyos küszöbértéket, akkor a szívizom típusú RyR (RyR2) diasztoléban megnyílik, ami aritmiák kialakulásához vezet. Jelenleg azonban nem tisztázott, hogy a vázizom típusú RyR (RyR1) pontmutációi miatt kialakuló leggyakoribb kórkép – az MHS – hátterében szintén hasonló molekuláris mechanizmus áll-e. Ezért vizsgálataim ennek kiderítésére irányultak. Az MHS a mutáns RyR1-ek illékony altatógázokkal szembeni halálos kimenetelű, túlérzékenységi reakciója. A legelterjedtebb nézet szerint a rianopátiák közös jellemzője a RyR SR [Ca2+]-ja iránti túlérzékenysége, de az ezzel kapcsolatos eredmények ellentmondásai miatt a hipotézis MHS esetén ellenőrzésre szorult. Az ellentmondások oka a SR lumen felé néző Ca2+-kötőhelyek szelektív vizsgálatának nehézsége, ugyanis a Ca2+ a RyR pórusán keresztül a citoplazmatikus oldalra átjutva az ott található Ca2+-kötőhelyeken keresztül is befolyásolhatja a csatorna működését, ami megnehezíti a luminális kötőhelyek szerepének elkülönítését. A probléma áthidalása érdekében a RyR Ca2+ általi szabályozásának vizsgálatára a Ca2+ helyett egy másik specifikus, de impermeábilis ligandot, az Eu3+-t használtuk, ami a RyR Ca2+-kötőhelyeinek oldalszelektív vizsgálatát tette lehetővé, így az MHS kórélettani folyamatának részleteit segített tisztázni. Az egyetlen, MHS krízisben alkalmazható forgalomban lévő gyógyszer a nem-depolarizáló izomrelaxáns dantrolen, aminek a klinikai bevezetése az MHS miatti halálozások számát látványosan lecsökkentette. Bár a szert 1967 óta használják, pontos hatásmechanizmusa részleteiben máig tisztázatlan. A RyR1-hez való specifikus kötődését már régen igazolták, a hatásával kapcsolatos tudományos bizonytalanság oka az a régi megfigyelés, hogy míg intakt vázizomrostokban a dantrolen RyR1-specifikus módon képes gátolni a Ca2+-felszabadulást, a csatornafehérje tisztításával és mesterséges lipid membránba építésével a dantrolen iránti érzékenység látszólag elvész. Munkánk során feltártuk az érzéketlenség okát és megmutattuk, hogy a dantrolen általi gátláshoz Mg2+ és ATP együttes jelenléte szükséges.Tétel Szabadon hozzáférhető Adaptor proteins in the vascular endothelium(2013-09-25T06:31:30Z) Boratkó, Anita; Csortos, Csilla; Boratkó, Anita; Molekuláris orvostudomány doktori iskola; DE--OEC--Általános Orvostudományi Kar -- Orvosi Vegytani IntézetVascular endothelial cell monolayer acts as a semiselective barrier between blood and the interstitium. Phosphorylation level of many cytoskeleton and cytoskeleton-associated proteins playing crucial role in the EC barrier function is critical to tissue and organ function. ERM-binding phosphoprotein 50 (EBP50) is a phosphorylatable PDZ domain-containing adaptor protein that is abundantly expressed in epithelium but was not yet studied in the endothelium. We found unusual nuclear localization of EBP50 in bovine pulmonary artery endothelial cells (BPAEC). Immunofluorescent staining and cellular fractionation demonstrated that EBP50 is present in the nuclear and perinuclear region in interphase cells. In the prophase of mitosis EBP50 redistributes to the cytoplasmic region in a phosphorylation dependent manner and during mitosis EBP50 co-localizes with protein phosphatase 2A. Furthermore, in vitro wound healing of BPAEC expressing phospho-mimic mutant of EBP50 was accelerated indicating that EBP50 is involved in the regulation of the cell division. Cell cycle dependent specific interactions were detected between EBP50 and the subunits of PP2A (A, C, and Bα) with immunoprecipitation and pull-down experiments. The interaction of EBP50 with the Bα containing form of PP2A suggests that this holoenzyme of PP2A can be responsible for the dephosphorylation of EBP50 in cytokinesis. Moreover, our results underline the significance of EBP50 in cell division via reversible phosphorylation of the protein with cyclin dependent kinase and PP2A in normal cells. TIMAP, TGF-β inhibited membrane-associated protein, is most abundant in endothelial cells with a regulatory effect on the endothelial barrier function, yet little is known about its interacting partners. RACK1, receptor for activated protein kinase C, serves as an anchor in multiple signaling pathways. We found that RACK1 binds to the TIMAP-PP1c complex in endothelial cells. WD1-4 repeats of RACK1 were identified as critical regions of the interaction both with TIMAP and farnesyl transferase. Phosphorylation of TIMAP by activation of the cAMP/PKA pathway reduced the amount of TIMAP-RACK1 complex and enhanced translocation of TIMAP to the cell membrane in vascular endothelial cells. However, both membrane localization of TIMAP and transendothelial resistance were attenuated after RACK1 depletion. Farnesyl transferase, the enzyme responsible for prenylation and consequent membrane localization of TIMAP, is present in the RACK1-TIMAP complex in control cells, but it does not co-immunoprecipitate with TIMAP after RACK1 depletion. Our results suggest that transient parallel linkage of TIMAP and farnesyl transferase to RACK1 could ensure prenylation and transport of TIMAP to the plasma membrane where it may attend in maintaining the endothelial barrier as a phosphatase regulator. A vaszkuláris endotél sejtek szemiszelektív barrierként választják el a keringő vért a környező szövetektől. A jól működő endotél barrier funció fenntartásában számos citoszkeletális és citoszkeleton asszociált fehérje foszforilációja fontos szerepet játszik. Az EBP50 (ezrin-radixin-moesin-binding phosphoprotein 50), egy olyan foszforilálható adaptor fehérje, mely epitél sejtekben magas expressziós szinttel rendelkezik azonban endotél sejtekben még nem vizsgálták. Immunfluoreszcens festéssel, valamint sejtfrakcionálással az EBP50 fehérjét az interfázisban lévő endotél sejtek magi régiójában detektáltuk. A mitózis profázisában foszforiláció-függő módon a sejtek citoplazmájába transzlokálódott és kolokalizáció volt megfigyelhető a protein foszfatáz 2A enzimmel. Az EBP50 foszforilációt utánzó mutánsát expresszáló sejtek gyorsabb in vitro sebgyógyálást mutattak, ami az EBP50 sejtosztódásban betöltött szabályozó szerepére utal. Immunprecipitációs és pull down kísérletekkel sikerült igazolnuk az EBP50 és a PP2A (A, C, és Bα) alegységei közötti sejtciklus függő kölcsönhatást. Eredményeink arra utalnak, hogy a PP2A enzim szerepet játszik az EBP50 fehérje defoszforilálásában normál sejtekben a sejtciklus során. A TIMAP (TGFβ inhibited membrane-associated protein) endotél sejtekben rendelkezik a legmagasabb expressziós szinttel, szerepéről és kölcsönható partnereiről azonban csak keveset tudunk. A RACK1 (Receptor for Activated C Kinase 1) adaptor fehérje, számos jelátviteli útvonalban játszik szerepet. Eredményeink alapján endotél sejtekben a RACK1 a TIMAP-PP1c komplexhez kötődik. A kölcsönhatásban a RACK1 WD1-4 doménjei vesznek részt, melyhez kötődik továbbá a farnezil-transzferáz enzim is. A cAMP/PKA útvonal aktiválásával elért TIMAP foszforiláció csökkentette a RACK1-TIMAP komplex mennyiségét, valamint a TIMAP membránban való feldúsulásához vezetett. A RACK1 depléciójával a TIMAP membránlokalizációja valamint a farnezil-transzferáz enzimmel való kölcsönhatása is megszűnt. Eredményeink alapján a RACK1 adaptor fehérje biztosítja a TIMAP prenilációját az ehhez szükséges farnezil-transzferáz enzimmel való kölcsönhatással.Tétel Szabadon hozzáférhető Adatértékelő eljárások sejtfelszíni fehérjemintázatok analízisére(2007-06-21T10:56:38Z) Szentesi, Gergely; Mátyus, László; Jenei, Attila; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Általános Orvostudományi Kar -- Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet; Elméleti orvostudományok doktori iskolaMunkánk során célunk volt három sejtfelszíni fehérje proximitás viszonyainak tanulmányozására alkalmas módszer szoftveres hátterének megteremtése, illetve a meglévő programok kiegészítése az adatok feldolgozását segítő programok létrehozásával. Mindhárom módszert alkalmaztuk egy-egy biológiai kérdés megválaszolására. Eredményeink a következők: • Kifejlesztettünk egy programot, melynek segítségével egyszerre több áramlási citometriás adatsor is analizálható párhuzamosan, valamint alkalmas a felhasználó által definiált aritmetikai kifejezések értékének sejtenkénti meghatározására és sorozatos alkalmazására. A programhoz olyan felhasználói felületet terveztünk, és olyan funkciókat implementáltunk, melyek segítik az analízis folyamatát, valamint az adatok áttekinthető elrendezését, az eredmények vizualizációját és értelmezését. Bemutattuk a program használatát az N87 gyomor tumor sejteken az ErbB2 sejtfelszíni receptorok két epitópja között mért energiatranszfer számításán keresztül, valamint összehasonlítottuk a korábban kidolgozott transzferszámítási módszereket. • Kifejlesztettünk egy szoftvercsomagot a fotohalványodási képsorozatok értékeléséhez, melynek segítségével leegyszerűsödik a nyert adatok feldolgozása és az eredmények interpretálása. Megvizsgáltuk az MHC I és II molekulák alegységeinek proximitásviszonyait JY sejteken a mért fotohalványodási képszekvenciák analízisével. • Kifejlesztettünk egy szoftvert az immuno-gold jelölt sejtfelszíni antigének helyzetének meghatározására elektronmikroszkópos képeken és elvégeztük Jurkat sejtek felszínén a Kv1.3 ioncsatornák eloszlásanalízisét első- és másodrendű paraméterek alapján.Tétel Szabadon hozzáférhető Adenozin receptor 2A kölcsönható fehérjék funkcionális vizsgálataSkopál, Adrienn; Kókai, Endre; Molekuláris orvostudomány doktori iskola; Debreceni Egyetem::Általános Orvostudományi Kar::Orvosi Vegytani IntézetAz A2AR-függő jelátvitel a makrofágokban kulcsszerepet játszik a gyulladás szabályozásában. A sejtfelszíni A2AR-ok szabályozzák a pro-inflammatorikus citokinek és kemokinek termelését, valamint az immunsejtek proliferációját és differenciálódását. Jelenlegi ismereteink szerint az A2AR C-terminális doménje és a vele kölcsönhatásba lépő fehérjék szabályozzák a receptor újrahasznosítását. Makrofágokban két A2AR kölcsönható partnert sikerült azonosítani, a CtsD proteázt és az NPC1 fehérjét, amelyek hatással lehetnek az A2AR kifejeződésére és aktivitására. Vizsgálataink azt igazolták, hogy az A2AR a CtsD szubsztrátja, valamint a CtsD aktivitásának gátlása növeli az A2AR mennyiségét és sejtfelszíni megjelenését makrofágokban. Az NPC1 és a teljes hosszúságú A2AR közötti kölcsönhatást vizsgáltuk a receptort tartósan expresszáló HEK-293 sejtekben és az A2AR-t endogén módon expresszáló RAW 264.7 makrofág sejtekben. Az A2AR aktiválása csökkenti az NPC1 mRNS és fehérje expresszióját LPS-aktivált egér peritoneális makrofágokban. Az A2AR stimulálása negatívan befolyásolja az NPC1 plazmamembrán irányú transzportját az LPS-stimulált makrofágokban. A LAMP2 és az EEA1 lizoszóma és endoszóma markerek expressziója és lokalizációja is megváltozott az A2AR aktiváció hatására makrofágokban.Tétel Korlátozottan hozzáférhető Adrenerg stimuláció hatása a szívizomsejtek akciós potenciáljára, és az őket kialakító ionáramokraRuzsnavszky, Ferenc; Magyar, János; Ruzsnavszky, Ferenc; Molekuláris orvostudomány doktori iskola; DE--Általános Orvostudományi Kar -- Élettani IntézetÖsszefoglalás Bevezetés Az izoproterenolnak (ISO) a kamrai szívizomsejtek ionáramaira, az akciós potenciálra (AP) gyakorolt hatásai nem kellően tisztázottak. Ezért vizsgáltuk az ISO módosító hatását az akciós potenciál konfigurációjára, az L-típusú kalciumáramra (ICa,L), valamint a késői egyenirányító áram lassú (IKs) és gyors (IKr) komponensére. Kitértünk a változások kinetikájának és frekvenciafüggésének vizsgálatára is. Anyagok és módszerek Az ICa, IKs, és IKr mérésekhez hagyományos feszültség-clamp technika egészsejtes konfigurációját, valamint akciós potenciál feszültség-clamp méréseket végeztünk. Az AP méréseket nagy ellenállású mikroelektródákkal végeztük, izolált kutya kamrai sejteken. Főbb eredmények Az ISO epikardiális és midmiokardiális sejteken az akciós potenciálok reverzibilis rövidülését okozta a plató emelésével együtt. Ezek a változások az IKs és ICa amplitúdóinak többszörös növekedésével jártak, az IKr mérsékelt fokú stimulálása mellett. Endokardiális sejteken az ISO nem okozott AP-rövidülést. Az IKr előzetes gátlása nem módosította az ISO hatását, de IKs blokkolásakor az akciós potenciál ISO hatására megnyúlt. A kalciumcsatornák előzetes gátlása mind az akciós potenciál rövidülését, mind a plató emelését megakadályozta. Megfigyeltük, hogy az ingerlési frekvencia csökkentésével az ISO nagyobb amplitúdóváltozást okozott az ICa és az IKs esetén. Az ISO okozta platónövekedés és az ICa növekedése hamarabb következett be, mint az akciós potenciál rövidülése, az IKr, vagy az IKs stimulálása. β blokkolókkal végzett kísérleteink során megállapítottuk, hogy a β1 receptorok gátlása az ISO okozta rövidülést nyújtássá változtatta, a platóváltozás latenciája pedig csökkent. Ezzel ellentétben, a β2 receptorok gátlása fokozta az AP rövidülését, és növelte a plató változásának latenciáját. Mindkét receptortípus egyidejű blokkolása meggátolta az ISO hatásának kifejlődését. A foszfodiészterázok gátlása csökkentette az időbeli különbséget a platópotenciál és az AP rövidülés megjelenése között. Összefoglalás Az ISO hatásai kutya kamrai sejteken nagyban függenek az akciós potenciál konfigurációjától, és az ISO-indukálta IKs és nem az IKr lehet a felelős az akciós potenciálok rövidüléséért. Az ISO az IKr, illetve az IKs változtatásánál gyorsabban, rövidebb latenciával növelte a kalciumáramot, a jelenségért a különböző adrenerg útvonalak, illetve a kompartmentalizáció lehet felelős. Summary Background and purpose Little is known about the role of action potential morphology in the isoproterenol (ISO) induced changes in ion currents. Therefore, the effects of ISO on action potential configuration, L-type Ca2+ current (ICa), slow component (IKs) and fast component (IKr) of the delayed rectifier K+ current were studied and compared in a frequency-dependent manner, along with the timing of activation of each current. Experimental approach Whole cell configuration of the patch-clamp technique in either conventional voltage clamp or action potential voltage clamp modes were used to monitor ICa, IKs, and IKr, while action potentials were recorded using sharp microelectrodes. Results In epicardial and midmyocardial cells ISO caused reversible shortening of action potentials accompanied by elevation of the plateau. These effects were associated with multifold enhancement of ICa and IKs and moderate stimulation of IKr. ISO-induced action potential shortening was absent in endocardial cells. IKr blockade failed to modify the ISO effect, while action potentials were lengthened by ISO in the presence of IKs blocker. Both action potential shortening and elevation of the plateau were prevented by pretreatment with ICa blocker. Both ICa and IKs currents increased with increasing the cycle length. The ISO-induced plateau shift and ICa increase developed earlier than the shortening of APD and stimulation of IKs and IKr. Blockade of β1 adrenoceptors converted the ISO-induced shortening of APD to lengthening, decreased the latency of the plateau shift. In contrast, blockade of β2 receptors augmented the APD-shortening effect and increased the latency of plateau shift. All effects of ISO were prevented by simultaneous blockade of both receptor types. Inhibition of phosphodiesterases decreased the differences observed in the turn on of the ISO induced plateau shift and APD shortening. Conclusion The effect of ISO in canine ventricular cells depends critically on action potential configuration, and the ISO-induced activation of IKs – but not IKr – may be responsible for the shortening of action potentials. ISO-induced activation of ICa is turned on faster than the stimulation of IKs and IKr in canine ventricular cells due to the involvement of different adrenergic pathways and compartmentalization.Tétel Szabadon hozzáférhető Agonist binding directs dynamic competition among nuclear receptors for heterodimerization with their common partner, retinoid X receptorFadel, Lina; Vámosi, György; Molekuláris orvostudomány doktori iskola; DE--Mezőgazdaság- Élelmiszertudományi és Környezetgazdálkodási Kar -- Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet; DE--Mezőgazdaság- Élelmiszertudományi és Környezetgazdálkodási Kar -- Biofizikai és Sejtbiológiai IntézetTracing the dynamic distribution pattern of EGFP-VDR, EGFP-PPAR/nlsm and EGFP-RARα/nlsm (homogeneous in the absence of RXRα and nuclear-enriched in response to RXRα binding) serves as a good model system for studying their competition for heterodimerization with RXRα. There is indeed dynamic competition between RXR partners, which is governed by two mechanisms. First, in the absence of agonist treatment, there is a hierarchy of affinities between RXRα and its partners in the following order: RARα > PPARγ > VDR. Second, in the presence of agonist treatment, RXRα partner selection is shifted towards the liganded partner. Our results also show that RXR-NR heterodimerization and direct DNA binding are correlated events, and both are augmented by agonist treatment. These results may explain certain side effects of drugs targeting NRs. Competition for RXR could be responsible for the symptoms of vitamin D deficiency developed in a child upon receiving systemic retinoid treatment for ichthyosis188, or the antagonistic effect of co-administered vitamin A on serum calcium response to vitamin D treatment189. Our observations regarding these three RXR partners, consistently with metabolism regulation by two other RXR partners (LXR and PPARα) and similar previous findings on membrane-localized IL-2/15 receptors encourage us to generalize the concept that specific ligand binding may often govern competition between different partners of a promiscuous receptor. Our findings are a proof-of-concept of a hierarchy of affinities between NRs and their common partner, RXRα. These studies can be extended to a larger number of receptors to uncover the network of hierarchies, and follow-up studies will also be focusing on testing this concept in a broader and physiological context. It is worth to mention that our or similar studies may have some limitations: i) we cannot entirely exclude the presence of endogenous ligands for the receptors; and ii) our approach may not mimic all possible physiological conditions; iii) as for the limiting nature of RXR, antibody-based approaches are at best semiquantitative to determine endogenous NR concentrations; iv) finally, we used indirect measures to assess downstream gene expression events.Tétel Szabadon hozzáférhető Agyaktiválásos PET-vizsgálatok protokolljának optimalizálása(2007-05-03T13:14:02Z) Emri Miklós; Márián Teréz; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Általános Orvostudományi Kar -- PET Centrum; Elméleti orvostudományok doktori iskolaTétel Szabadon hozzáférhető Alternations in myocardial function and contractile proteins during human heart failure(2007-03-07T10:45:47Z) Borbély, Attila; Papp, Zoltán; Velden, Jolanda van der; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Általános Orvostudományi Kar -- Kardiológiai Intézet -- Klinikai Fiziológiai Tanszék; Elméleti orvostudományok doktori iskolaIsometric force generation and its Ca2+-sensitivity were measured in single, permeabilized human ventricular myocytes and biochemical methods were employed to identify changes in myofilamentary proteins. In vitro administration of the reactive nitrogen species peroxynitrite decreased the maximal Ca2+-activated isometric force (Fmax) to zero in a concentration-dependent manner, and this was accompanied by a marked deterioration of the cross-striation pattern of the myocytes. However, there were no differences before and after the application of 50 µM peroxynitrite in the Ca2+-sensitivity of force production (pCa50), in the steepness of the Ca2+-force relation and in the actin-myosin turnover kinetics. Western immunoblots and subsequent immunoprecipitation assays identified a peroxynitrite-induced nitration of a major Z-line protein, α-actinin. These results suggest α-actinin as a novel target for peroxynitrite in the human myocardium. Heart failure with preserved left ventricular ejection fraction (referred to as diastolic heart failure - DHF) is currently diagnosed in as much as 49% of heart failure patients. Despite the increased recognition of DHF, its pathophysiology remains incompletely understood. Endomyocardial biopsies obtained in DHF patients were therefore analyzed for collagen volume fraction (CVF) and sarcomeric protein composition and compared to control biopsies. Cardiomyocytes of DHF patients developed similar total isometric force at maximal Ca2+ concentration than controls, but their resting tension (Fpassive) in the absence of Ca2+ was almost twice as high. Administration of protein kinase A (PKA) to DHF cardiomyocytes lowered Fpassive to control value. In addition Fpassive and CVF combined yielded significant correlations with in vivo measured hemodynamic indices. Together with CVF, Fpassive determined in-vivo diastolic LV dysfunction. Correction of this high Fpassive by PKA suggests that reduced phosphorylation of sarcomeric proteins is involved in DHF. These hypophosphorylated sarcomeric proteins could, together with extracellular matrix modification, be specific myocardial targets for drug therapy of DHF. Ca2+-sensitizers represent a new class of inotropic drugs. In our study an attempt was made to quantify the magnitude of the effects of two Ca2+-sensitizers (EMD 53998 and OR-1896) in cardiomyocytes from end-stage failing (NYHA IV) and non-failing donor hearts under control conditions (pH 7.2; no added inorganic phosphate (Pi)) and under mimicked ischaemic conditions (pH 6.5; 10 mM Pi). Fmax and Fpassive did not differ between the failing and non-failing myocytes, but pCa50 was significantly lower in the failing than in the non-failing myocytes (ΔpCa50=0.15). This difference in Ca2+-sensitivity, however, was abolished during mimicked ischaemia. EMD 53998 increased Fmax and Fpassive by approximately 15% of Fmax and greatly enhanced the Ca2+-sensitivity (ΔpCa50>0.25) of force production. OR-1896 did not affect Fmax and Fpassive, and provoked a small, but significant Ca2+-sensitization (ΔpCa500.1). All of these effects were comparable in the donor and failing myocytes, but, in contrast with OR-1896, EMD 53998 considerably diminished the difference in the Ca2+-sensitivities between the failing and non-failing myocytes. The action of Ca2+-sensitizers under mimicked ischaemic conditions was impaired to a similar degree in the donor and the failing myocytes. Our results indicate that the Ca2+-activation of the myofibrillar system is altered in end-stage human heart failure. This modulates the effects of Ca2+-sensitizers both under control and under mimicked ischaemic conditions. Taken together, the measurement of force generation in isolated cardiomyocytes in combination with biochemical assays to determine myocardial protein alterations are appropriate, reliable and valuable methods for the characterization of human heart failure.Tétel Szabadon hozzáférhető Antihiperglikaemiás szerek tervezése és vizsgálata a glikogén foszforilázra ható inhibitorokkal(2012-01-19T10:13:08Z) Docsa, Tibor; Gergely, Pál; Molekuláris orvostudomány doktori iskola; DE--OEC--Általános Orvostudományi Kar -- Orvosi Vegytani Intézet; DE--ATC--Mezőgazdaság- Élelmiszertudományi és Környezetgazdálkodási Kar -- DE--OEC--Általános Orvostudományi Kar --; DE--ATC--Mezőgazdaság- Élelmiszertudományi és Környezetgazdálkodási Kar -- DE--ATC--Mezőgazdaság- Élelmiszertudományi és Környezetgazdálkodási Kar --; DE--ATC--Mezőgazdaság- Élelmiszertudományi és Környezetgazdálkodási Kar --A máj glikogén elsődleges feladata a glükóz raktározása, reverzibilis lebomlási és felépítési folyamataival hozzájárul a vércukorszint fenntartásához. Izomban és májban a glikogén szintézise és lebontása a GF és a GS enzimek szabályozásával történik. A GF a glikogén lebontásának első lépését katalizálja, az enzim aktivitása többek között gátolható glükózzal és glükózanalóg vegyületekkel. Feltételezhető, hogy a GF gátlószerei alkalmasak lehetnek a II. típusú diabétesz terápiás kezelésére, a máj enzimet, mint a gyógyszerkísérletek lehetséges célpontját azonosították. Jelen munkánk egyik célja, hogy megvizsgáljuk az újonnan szintetizált glükózanalóg inhibitorok nyúl vázizomból és patkány májból tisztított GF-re kifejtett gátló hatását. Vizsgálataink során azonosítottunk egy spiro-tiohidantoin származékot, amelynek a GF-ra kifejtett gátlási állandója (Ki) a mikromólos tartományba esik. Több olyan szubsztituált karbamidszármazékot is azonosítottunk, amelyek a GF jó gátlószerei, röntgenkrisztallográfiás adatok alapján az enzim aktív centrumához és a nemrégiben felfedezett új allosztérikus gátlóhelyéhez kötődik az egyik ilyen vegyület. A glükopiranozilidén-spiro-tiohidantoin (TH) mind a vázizom, mind a máj GF enzimek hatékony gátlószere. Kimutattuk, hogy 50 mikroM TH Wistar patkányok májából készített gélszűrt kivonatban felfüggesztette a GF és GS koordinált szabályozását, megszüntette a latenciát a GS aktiválásában. Sztreptozotocin-indukált diabéteszes állatokban a TH kezelés hatására jelentősen csökkent a vércukorszint és növekedett a máj glikogéntartalma. Elhízott Zucker diabéteszes patkányokat i.v. TH-val kezelve a kontrollhoz képest jelentősen csökkent a máj GFa szintje és a GS aktiválódása is gyorsult. Vizsgáltuk a TH hatását kontroll és sztreptozotocin indukált diabéteszes patkányok inzulinérzékenységére és vércukorszintjére. A TH fokozta az inzulinérzékenységet a kezelt állatokban elősegítve ezzel a vércukor-koncentrációjának helyreállítását. The major role of hepatic glycogen is to supply glucose to the circulation maintaining the normal blood glucose level. In muscle and liver, the accumulation and breakdown of glycogen are regulated by the reciprocal activities of glycogen phosphorylase and glycogen synthase. Glycogen phosphorylase catalyses the key step of glycogen degradation and its activity can be inhibited by glucose and its analogues. Obviously, any readily accessible inhibitor of glycogen phosphorylase can be used as a potential therapy of non-insulin-dependent or type 2 diabetes. Hepatic glycogen phosphorylase has been identified as a new target for drug design that control blood glucose concentration. One of the aims of our present study was studying the newly synthesized glucose analogue inhibitors by assaying the inhibitory potential with purified rabbit muscle or rat liver glycogen phosphorylases. Our investigations showed that spiro-thiohydantoin derivatives are very potent inhibitors with Ki values in the low micromolar range. Furthermore, substituted urea compounds have been identified as good inhibitors also binding to the active centre and the recently discovered new allosteric binding site of glycogen phosphorylase as revealed by crystallographic studies. By the assay of several glucose derivatives as possible inhibitors of glycogen phosphorylase structure-activity relationships were analyzed. Glucopyranosylidene-spiro-thiohydantoin (TH) was found as one of the most potent glucose derivate which inhibits the catalytic activity of both muscle and liver glycogen phosphorylase. We have demonstrated the co-ordinated regulation of glycogen phosphorylase and synthase by 50 microM TH in liver extracts of Wistar rats resulting in the activation of synthase by shortening the latency compared with control animals. TH was also effective in lowering blood glucose level and restoring hepatic glycogen content in streptozotocin-induced diabetic rats. Furthermore, intravenous administration of TH to Zucker diabetic fatty rats significantly decreased the hepatic glycogen phosphorylase a level and the activation of synthase started without any delay. TH was also tested on the insulin sensitivity and blood glucose level of control and streptozotocin-treated rats. TH increased the insulin sensitivity and also contributed to the partial restoration of blood glucose level of treated animals proving its efficiency as a possible antihyperglycaemic agent.Tétel Szabadon hozzáférhető Antioxidáns és sejtvédő hatású vegyületek azonosítása nagy áteresztőképességű módszerrel és vizsgálatuk emlős sejtmodellekbenGergely, Szabolcs; Virág, László; Molekuláris orvostudomány doktori iskola; DE--Általános Orvostudományi Kar -- Orvosi Vegytani IntézetA Debreceni Egyetem kutatói által létrehozott molekulakönyvtár 1863 vegyületéből 29 védett a hidrogén-peroxid által indukált citotoxicitás ellen Jurkat sejtekben. Ezen vegyületek közül 11 antioxidáns aktivitással is rendelkezett, és kettőt találtunk hatékony PARP gátlónak. Négy sejtvédő dibenzoil-metán (DBM) származékot részletesen is tanulmányoztunk, mert nem rendelkeztek antioxidáns hatással, és nem gátolták a PARP enzim aktivitását. A négy DBM származék védelmet nyújtott a nekrotikus sejthalállal szemben, míg nem befolyásolta az apoptotikus útvonalra jellemző kaszpáz aktivitását. A hidrogén-peroxid fokozta az extracelluláris jellel szabályozott kinázok közül az ERK 1/2 és p38 MAP kinázok foszforilált formájának mennyiségét, de nem módosította a c-Jun kináz hatását. A DBM származékok csak a hidrogén-peroxid által fokozott foszfo-ERK 1/2 mennyiségét csökkentették. A vegyületek sejtvédő hatását A549 tüdő epitélsejtekben is igazoltuk bizonyítva, hogy hatásuk nem sejtspecifikus. Az új típusú DBM vegyületek a sejtvédő anyagok új osztályát alkotják, mert gátolják az ERK 1/2 kinázt és védenek a nekrotikus sejthaláltól anélkül, hogy módosítanák a PARP aktvitását. Az egyik legáltalánosabban használt tumorellenes antraciklin a doxorubicin, amit sikeresen alkalmaznak a legkülönbözőbb szervek tumorellenes kemoterápiájában. A gyógyszer alkalmazásának egyik hátránya súlyos kardiotoxikus hatása, mert a doxorubicin kezelés a beteg teljes életciklusában kumulálódik. A doxorubicin tumorellenes hatása és kardiotoxicitása eltérő molekuláris mechanizmusokon alapszik, ezért lehetőség van arra, hogy a súlyos mellékhatás kiküszöbölésével érintetlenül hagyjuk tumorellenes hatását. A Chembridge Diverset molekula könyvtár 9680 vegyületét vizsgáltuk H9C2 patkány kardiomiocitákban a doxorubicin kezeléssel kiváltott sejthalálban. Életképességi és sejtmorfológián alapuló módszerekkel választottuk ki a vegyületeket. A leghatékonyabb molekula jelentősen csökkentette a doxorubicin által kiváltott apoptotikus és nekrotikus sejthalált, ugyanakkor nem rendelkezett zabadgyökfogó képességgel, és nem befolyásolta a doxorubicin tumorellenes hatását. A benzimidazolt tartalmazó vegyületünk – további kémiai szerkezet optimalizálással – alkalmasnak tűnik gyógyszerjelölt fejlesztésre, ami a szívizom doxocubicin által okozott sérüléseit kivédheti.Tétel Szabadon hozzáférhető Áramlási citometriás fret mérések optimalizálása és alkalmazása a majdnem teljes ErbB2 molekula modellezésében(2007-05-04T17:29:19Z) Horváth, Gábor; Szöllősi, János; Vereb, György; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Általános Orvostudományi Kar -- Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet; Elméleti orvostudományok doktori iskolaMunkánk két fő célja az volt, hogy fluoreszcencia rezonancia energiatranszfer (FRET) alapú epitóp térképezési és molekuláris modellezési eljárásokkal az ErbB2 receptor és dimerjének molekuláris modelljét megszerkesszük, valamint, hogy megállapítsuk újonnan kifejlesztett fluoreszkáló festékek és áramlási citométerek használhatóságát áramlási citometriás FRET (FCET) mérésekben. Vizsgálataink eredményei a következők: • Az általunk vizsgált hét fluoreszkáló festék segítségével megállapítottuk a sejtek felszínén lévő membránfehérjék asszociációjának áramlási citometriás tanulmányozásához nélkülözhetetlen paramétereket, melyek a normalizált fluoreszcencia intenzitás, a transzfer átmenet nagyságára jellemző átfedési integrál (vagy kritikus Förster távolság), a normalizált FRET hatékonyság, valamint a festékek gerjeszthetőségét figyelembe vevő efr együttható. • Az általunk vizsgált három áramlási citométeren azt találtuk, hogy a FCET mérésekhez az Alexa546-Alexa647 és az Alexa555-Cy5 donor-akceptor festékpár optimális. • FCET mérésekben meghatároztuk az ErbB2 receptor különböző epitópjaihoz kötődő, fluoreszkáló festékekkel jelzett antitestek egymástól és a sejtmembrántól való távolságait. • A fenti távolság és irodalmi kristályszerkezeti adatok alapján, molekulamodellezési eljárások segítségével megszerkesztettük a majdnem teljes ErbB2 transzmembrán receptor molekuláris modelljét, amely tartalmazta az extracelluláris domént, a transzmembrán régiót és a tirozinkináz domént, valamint az ezeket összekötő szakaszokat. Az antitesttel jelölt ErbB2 molekulák között mért FRET hatékonyság értékek alapján felállítottunk egy lehetséges modellt az ErbB2 receptor dimerre, amely az EGFR dimerhez hasonló módon kapcsolódott össze, valamint rámutattunk több lehetséges dimerizációs felszínre a külső membránközeli összekötő szakasznál, a transzmembrán, valamint a tirozinkináz régióknál.