Molekuláris Orvostudomány Doktori Iskola
Állandó link (URI) ehhez a gyűjteményhez
Általános Orvostudományi Kar
Molekuláris Orvostudomány Doktori Iskola
(vezető: Dr. Csernoch László)
Orvostudományi doktori tanács
D42
tudományág:
-elméleti orvostudományok
Doktori programok:
- Jelátviteli folyamatok sejt- és molekuláris biológiája
(programvezető: Dr. Virág László) - Membránbiofizikai kérdések és vizsgálómódszerek
(programvezető: Dr. Szöllősi János) - Élettan és neurobiológia
(programvezető: Dr. Csernoch László)
Böngészés
Molekuláris Orvostudomány Doktori Iskola Szerző szerinti böngészés "Almássy, János"
Megjelenítve 1 - 3 (Összesen 3)
Találat egy oldalon
Rendezési lehetőségek
Tétel Szabadon hozzáférhető A vázizom rianodin receptorának Ca2+-függő és gyógyszeres szabályozásaMagyar, Zsuzsanna Édua; Almássy, János; Molekuláris orvostudomány doktori iskola; Debreceni Egyetem::Általános Orvostudományi Kar::Élettani IntézetA megfelelő sejtműködés fenntartásához elengedhetetlen az intracelluláris kalciumion koncentráció ([Ca2+]IC) precíz szabályozása. A szabályozás fontos eleme a szarkoplazmás retikulum (SR) Ca2+ csatornája, a rianodin receptor (RyR), ami számos sejttípus [Ca2+]IC-nak a megemelésében szerepel. Fontosságát jól mutatja, hogy a RyR genetikai hiánya az élettel összeegyeztethetetlen, pontmutációi pedig olyan rendellenes csatornaműködést eredményeznek, amely szívritmuszavarokhoz, izomgyengeséghez, vagy éppen fokozott izomtónushoz, malignus hipertermia szindrómához (MHS) vezethetnek. Ezeket a kórképeket összefoglaló néven rianopátiáknak nevezzük. Munkánk során azt próbáljuk megérteni, hogy a RyR működését érintő, molekuláris szintű elváltozások hogyan függenek össze a vázizmokat és a szívet érintő tünetekkel, és hogy ezek a kóros folyamatok gyógyszeres terápiával hogyan fordíthatók vissza. Az irodalomban elfogadott tény, hogy ha a kardiomiociták SR Ca2-töltöttsége meghalad egy bizonyos küszöbértéket, akkor a szívizom típusú RyR (RyR2) diasztoléban megnyílik, ami aritmiák kialakulásához vezet. Jelenleg azonban nem tisztázott, hogy a vázizom típusú RyR (RyR1) pontmutációi miatt kialakuló leggyakoribb kórkép – az MHS – hátterében szintén hasonló molekuláris mechanizmus áll-e. Ezért vizsgálataim ennek kiderítésére irányultak. Az MHS a mutáns RyR1-ek illékony altatógázokkal szembeni halálos kimenetelű, túlérzékenységi reakciója. A legelterjedtebb nézet szerint a rianopátiák közös jellemzője a RyR SR [Ca2+]-ja iránti túlérzékenysége, de az ezzel kapcsolatos eredmények ellentmondásai miatt a hipotézis MHS esetén ellenőrzésre szorult. Az ellentmondások oka a SR lumen felé néző Ca2+-kötőhelyek szelektív vizsgálatának nehézsége, ugyanis a Ca2+ a RyR pórusán keresztül a citoplazmatikus oldalra átjutva az ott található Ca2+-kötőhelyeken keresztül is befolyásolhatja a csatorna működését, ami megnehezíti a luminális kötőhelyek szerepének elkülönítését. A probléma áthidalása érdekében a RyR Ca2+ általi szabályozásának vizsgálatára a Ca2+ helyett egy másik specifikus, de impermeábilis ligandot, az Eu3+-t használtuk, ami a RyR Ca2+-kötőhelyeinek oldalszelektív vizsgálatát tette lehetővé, így az MHS kórélettani folyamatának részleteit segített tisztázni. Az egyetlen, MHS krízisben alkalmazható forgalomban lévő gyógyszer a nem-depolarizáló izomrelaxáns dantrolen, aminek a klinikai bevezetése az MHS miatti halálozások számát látványosan lecsökkentette. Bár a szert 1967 óta használják, pontos hatásmechanizmusa részleteiben máig tisztázatlan. A RyR1-hez való specifikus kötődését már régen igazolták, a hatásával kapcsolatos tudományos bizonytalanság oka az a régi megfigyelés, hogy míg intakt vázizomrostokban a dantrolen RyR1-specifikus módon képes gátolni a Ca2+-felszabadulást, a csatornafehérje tisztításával és mesterséges lipid membránba építésével a dantrolen iránti érzékenység látszólag elvész. Munkánk során feltártuk az érzéketlenség okát és megmutattuk, hogy a dantrolen általi gátláshoz Mg2+ és ATP együttes jelenléte szükséges.Tétel Szabadon hozzáférhető Kalcium függő ioncsatornák szerepe szekretoros epitélsejtek működésébenDiszházi, Gyula; Almássy, János; Molekuláris orvostudomány doktori iskola; DE--Általános Orvostudományi Kar -- Élettani IntézetA kutatásom során enzimatikus emésztéssel izolált könny- és hasnyálmirigy acinus sejteken vizsgáltam különböző ioncsatornák szerepét, plazma membránban való elhelyezkedését és működésbeli összefüggéseiket az intracelluláris Ca2+-koncentrációval [Ca2+]i. Az elsődleges könnyszekrétum kiválasztása az egyrétegű epitél sejtrétegen, egyirányba transzportált vízen és ionokon alapszik. Ez a mechanizmus mind a transzporterek, mind az intracelluláris Ca2+-jel aszimmetrikus apiko-bazális eloszlását követeli meg. Az egér könnymirigy acinus sejtekben a Ca2+-függő ioncsatornák azonosítása és lokalizálása volt a fő célunk. Az eredményeink azt mutatják, hogy a Ca2+-függő K+-áram paxillin érzékeny, elhelyezkedése apikálisan kifejezett, bazálisan elhanyagolható, és a Ca2+-függő Cl--árammal azonos membránkompartmentben helyezkedik el. Mindebből feltételezhető, hogy a K+ és a Cl- is az acinuslumenbe szekretálódik, amely magyarázatot ad a primer szekrétum magas luminális Cl- koncentrációjára (∼141 mM), de ellentmond az alacsony K+-koncentrációnak (<17 mM). Az előzőekből következik, hogy a K+ valamilyen mechanizmussal visszajut az acinus sejtbe az elsődleges könnyszekrétumból, ezért feltételeztük a Na+-K+ pumpa jelenlétét a plazma membrán apikális részén. A hipotézist specifikus Na+-K+-pumpa antitest alkalmazásával végzett immunfestéssel ellenőriztük, és igazolást nyert, hogy a bazális mellett az apikális oldalon is található Na+-K+ pumpa a könnymirigy acinus sejten. Eredményeink alapján egy új könnyszekréciós modellt javaslunk, melyben a paracelluláris Na+-transzport kiegészül egy transzcelluláris útvonallal, az ehhez szükséges hajtóerőt pedig a Na+-K+-pumpa biztosítja. Az elsődleges hasnyálmirigy-szekrétum kiválasztásában jelentős szerepe van a hasnyálmirigy acinus sejt [Ca2+]i-jának, ezért célunk az acinus sejtek Ca2+-függő ioncsatornáinak feltérképezése, szerepük tisztázása volt. A QPCR tesztünk alapján nagy expressziót mutatott a TRPM4 csatorna a mirigyben, ezért kísérleteink során az egér hasnyálmirigy acinus sejtekben vizsgáltuk ezen csatorna szerepét. A TRPM4 csatorna egy Ca2+-aktivált nem szelektív monovalens kation csatorna, ezért feltételeztük, hogy a szekretagóg stimulus hatására megemelkedő [Ca2+]i aktiválja azt, és a rajta keresztül a sejtbe áramló kationok depolarizálják a sejtet, a Ca2+ hajtóereje lecsökken, így alacsonyabb lesz a beáramló Ca2+ mennyisége. Kísérleteink során patch-clamp módszerrel igazoltuk, hogy egér hasnyálmirigy acinus sejten található Ca2+-aktivált Na+-áram, amely a TRPM4 gátlószereivel (CBA, 9-Phenanthrol) gátolható volt. Továbbá áram-clamp körülmények között igazoltuk, hogy a Ca2+-függő Na+-áram a sejtmembrán átlagos ∼17 mV-os depolariációját okozza, amely szintén gátolható volt CBA-val. Annak érdekében, hogy tesztelhessük a depolrizáció hatását a Ca2+-beáramlásra, [Ca2+]i méréseket végeztünk, amelyek alapján megállapítható, hogy a Ca2+ beáramlás meredeksége TRPM4 génkiütött és CBA-val kezelt acinus sejteken magasabb a kontrollhoz képest, míg a TRPM4 génkiütött sejteken a Ca2+ beáramlásából származó intracelluláris Ca2+-jel amplitudója is emelkedett. Az eredményeink alapján igazolást nyert a hipotézisünk, miszerint a TRPM4 aktivációja csökkenti a Ca2+-beáramlás hajtóerejét a plazmamembránon keresztül.Tétel Korlátozottan hozzáférhető A vázizomgyengeség és a rianodin receptor kapcsolata krónikus szívelégtelenségbenAlmássy, János; Jóna, István; Molekuláris orvostudomány doktori iskola; DE--OEC--Általános Orvostudományi Kar -- Élettani IntézetA szívinfarktust követő elégtelen szívműködés következtében a perifériás izomzat tömegének és kontrakciós erejének jelentős csökkenése figyelhető meg. Az izomgyengeség mértékét a romló perfúzió és a hosszas ágynyugalommal járó csökkenő fizikai aktivitás nem indokolja, ezért az elektromechanikai kapcsolat és a vázizomrost kalciumtranszport mechanizmusainak molekuláris szintű sérülése feltételezhető. Munkánk során az elektromechanikai kapcsolat egyik kulcsfehérjéjét, a szarkoplazmatikus retikulum Ca2+csatornáját (rianodin receptor, RyR) vizsgáltuk miokardiális infarktuson átesett patkányokon. Az állatok vázizmából RyR-t izoláltunk majd mesterséges lipid kettősrétegbe építésük után feszültség-clamp körülmények között regisztráltuk a csatornák áramát. Célunk a posztinfarktusos RyR esetleges funkcionális eltéréseinek azonosítása mellett egy gyógyszerjelölt vegyület, a K201 rianodin receptorra gyakorolt hatásának vizsgálata volt, mely állatkísérletekben miokardiális infarktus után RyR támadásponttal javítja az izom teljesítményét. Eredményeink szerint a beteg állatokból származó rianodin receptorok egy részének vezetőképessége ~50 százalékkal nagyobb, mint az egészséges patkányokból izoláltaké, valamint a csatornák a Ca2+ inaktiváló hatásával szemben mutatott érzékenysége alacsonyabb, mely a Ca2+-felszabadulás terminációjának zavarát és az SR deplécióját okozhatja, ami az izom kontrakciós erejének csökkenéséhez vezethet. A K201 RyR-re gyakorolt hatásával kapcsolatban megállapítottuk, hogy a vegyület a RyR-t dózisfüggő módon, kétféle csökkent vezetőképességű, szubkonduktancia-állapotban blokkolja, ezzel csökkentve annak nyitvatartási valószínűségét. A K201 hatásának jellege és dózisfüggése a beteg állatokból származó RyR-ok tekintetében különbséget nem mutatott. Munkánk másik felében egy skorpiótoxin, a maurocalcine (MCa) szívizom típusú RyR-ra gyakorolt hatását vizsgáltuk. A MCa egy 33 aminosavból álló peptid, mely homológ elsődleges szerkezetet mutat a DHPR azon szakaszával, mely a vázizomban a RyR-t közvetlen mechanikai kapcsolat útján megnyitja. Ez a hasonlóság a MCa-t az elektromechanikai kapcsolat vizsgálatának jó eszközévé teszi. Munkacsoportunk a MCa szív- és vázizom típusú RyR-ra gyakorolt hatásának különbözőségeit kívánta jellemezni. Eredményeink szerint a MCa – a vázizom típusú RyR-ra gyakorolt hatásához hasonlóan – a szívizom típusú RyR-t is hosszantartó szubkonduktív állapotban rögzíti, de azok átlagos hossza rövidebb és frekvenciája nagyobb, mint vázizom esetében. ----- In heart failure (HF) exercise intolerance characterized by skeletal muscle weakness and fatigue develops that could not be explained by the reduced muscle perfusion but rather by reduced Ca2+ content of the sarcoplasmic reticulum (SR) and the consequent reduction of calcium transients’ amplitude, both indicating impaired calcium transport mechanisms. Our aim beside the identification of putative functional Ca2+-release channel (RyR1) changes contributing to the symptoms was to elucidate the effect of a new drug K201 on channel gating. K201 has been suggested as a potential therapeutic agent in HF due to its antiarrhythmogenic action and ability to avoid muscle weakness in HF model animals. For these purpose single RyR1 channels from rats with HF were reconstituted into planar lipid bilayer and the gating behavior was studied under voltage-clamp conditions. Significant portion of RyRs showed ~50% higher conductance compared to RyRs from control rats and the voltage dependence of the channel conductance was, showing still ohmic but rectifying, polarity dependent conductance. Altered Ca2+-dependency of channel activity was also observed on RyRs from HF afflicted rats, such as reduced sensitivity to calcium dependent inactivation, which can lead to SR depletion. K201 induced two subconductance states corresponding to approximately 24% (S1) and 13% (S2) of the maximum conductance. Dependence of event frequency and of time spent in S1 and S2 on the drug concentration was biphasic both in control and in PMI rats, with a maximum at 50 µM. At this concentration, the channel spends 26±4% and 24±4%, respectively, of the total time in these subconductive states at positive potentials, while no subconductances are observed at negative potentials. Taken together K201 action on RyR1 can be interpreted as a definite inhibition. I also investigated the effect of a 33 amino acid toxin maurocalcine (MCa) on the gating properties of RyR from canine heart. MCa is a suitable research tool of electromechanical coupling because it mimics a DHPR segment responsible for allosteric coupling between DHPR and RyR in skeletal muscle. Our aim was to describe the potential differences of our results obtained on skeletal (RyR1) and cardiac (RyR2) type RyR in the presence of MCa. MCa induced long lived subconductive states (LLSS) of RyR2 channel, just like it did in the case of RyR1 with a slight difference: the duration of LLSSs are shorter and the frequency of LLSSs are higher compared to RyR1, indicating weaker electrostatic forces. These results highlight a different role of the MCa-binding domains in the gating process of RyR1 and RyR2.