Laki Kálmán Doktori Iskola

Állandó link (URI) ehhez a gyűjteményhez

https://hdl.handle.net/2437/2311

Általános Orvostudományi Kar

Laki Kálmán Doktori Iskola
(vezető: Dr. Balla József)

Orvostudományi doktori tanács

D43

tudományágak:
- elméleti orvostudományok
- klinikai orvostudományok

Doktori programok:

  • Trombózis, hemosztázis és vaszkuláris biológia
    (programvezető: Dr. Muszbek László)
  • Hematológia
    (programvezető: Dr. Kiss Csongor)
  • Kardiovaszkuláris megbetegedések
    (programvezető: Dr. Édes István)

Böngészés

Laki Kálmán Doktori Iskola Tárgyszó szerinti böngészés "a véralvadás XIII-as faktora"

Megjelenítve 1 - 1 (Összesen 1)
  • Nincs kép
    TételKorlátozottan hozzáférhető
    A XIII-as véralvadási faktor alegységek egymással, és glutamin tartalmú szubsztrátokkal való kölcsönhatásának tanulmányozása
    Pénzes-Daku, Krisztina; Muszbek, László; Pénzes, Krisztina; Laki Kálmán doktori iskola; DE--Általános Orvostudományi Kar -- Klinikai Laboratóriumi Kutató Tanszék
    A véralvadás XIII-as faktora (FXIII) egy heterotetramer, mely két katalitikus A alegységből (FXIII-A2) és két védő/gátló B alegységből áll (FXIII-B2). Az FXIII-B tíz, ún. sushi doménből felépülő mozaik fehérje, mely szignifikánsan meghosszabbítja a katalitikus alegység féléletidejét a keringésben, és meggátolja lassú, progresszív aktivációját a plazmában. Figyelembe véve az FXIII alegységek közötti komplex kialakulásának fontosságát meglepő, hogy a kölcsönhatás biokémiája felületesen tanulmányozott és az FXIII alegységeinek egymáshoz való kötődéséről igen keveset tudunk. Ez idáig mindössze két munkacsoport foglalkozott az A és B alegységek közötti kölcsönhatás vizsgálatával, ám az általuk közölt egyensúlyi disszociációs állandó (Kd) értékeivel végzett számítások ellentmondanak a kísérletes adatoknak. Az aktivált FXIII (FXIIIa) a trunkált A-alegység Ca2+ által aktivált dimer formája (FXIII-A2*), egy transzglutamináz, mely keresztköti az elsődleges aminokat peptid kötésben lévő glutamin reziduumokkal. Mivel az FXIII-A2* természetes glutamin donor peptid szubsztrátjainak nem azonosítható egy konszenzus szekvenciája a reaktív glutamin körül, fontosnak tartottuk tanulmányozni egy fiziológiás szempontból fontos szubsztrát és az FXIII-A2* közötti kölcsönhatást. Az α2 plazmin inhibitor (α2PI; más néven α2 antiplazmin) molekulák nagy részét egy plazma proteáz hasítja, és a trunkált izoforma (N1-α2PI) igen fontos szubsztrátja az FXIII-A2*-nak. Az N1-α2PI fibrinhez való keresztkötése az FXIIIa által nagy szerepet játszik a fibrin fibrinolízissel szembeni védelmében. Munkánk során az FXIII két alegysége közötti kölcsönhatás biokémiáját, és az FXIII-A2* N1-α2PI N-terminális szakaszának megfelelő dodekapeptid glutamin donor szubsztrátjával (N1-α2PI(1–12)) kialakított kölcsönhatását tanulmányoztuk. Felszíni plazmon rezonanciát és ELISA-típusú kötődési vizsgálatot alkalmazva az FXIII alegységek kölcsönhatását jellemző Kd-t 10-10 M tartományban állapítottuk meg. A mért Kd érték alapján kiszámítottuk, hogy az FXIII-A2 kb. 1%-a szabad formában található a plazmában. Ezt az eredményt kísérletesen is megerősítettük a szabad FXIII-A2 mérésével, miután immundeplécióval a plazmából mind az FXIII-A2B2-t mind az FXIII-B2-t eltávolítottuk. A szabad FXIII-A2 funkcionálisan intakt, trombinnal és Ca2+-mal aktiválható volt, és aktiváció után a fibrint keresztkötötte. A sokkal alacsonyabb FXIII alegység koncentrációjú cerebrospinális folyadékban és könnyben az FXIII-A2 több mint 80%-a van szabad formában. Az N1-α2PI(1–12)-t és trunkált vagy szintetikus mutánsait jellemző kinetikai paramétereket spektrofotometriás FXIIIa aktivitás méréssel határoztuk meg. Az N1-α2PI(1–12) és az FXIII-A2* kölcsönhatását proton mágneses magrezonanciával (NMR) és telítés-átviteli differencia (STD, saturating transfer difference) NMR-rel tanulmányoztuk. A peptidek Asn1-trunkált vagy alaninra cserélt változataival kapott kinetikai eredmények, és az FXIIIA2*– N1-α2PI(1–12) komplex proton NMR analízise egyértelműen mutatták, hogy az Asn1 esszenciális a hatékony enzim-szubsztrát kölcsönhatáshoz. A C-terminálisan trunkált peptidekkel végzett kísérletek igazolták, hogy a 7-12 pozíciójú aminosavak esszenciális szerepet játszanak az N1-α2PI(1–12) és az enzim közötti kölcsönhatásban, mely egy másodlagos szubsztrát kötőhely létezésére enged következtetni az FXIII-A2*-on. Úgy tűnik, hogy a hidrofób reziduumok, elsősorban a Leu10 és a C-terminális Lys12 különösen fontosak ebben a tekintetben. A közvetlen kölcsönhatást a hidrofób C-terminális reziduumok és az FXIII-A2* között STD NMR technikával bizonyítottuk. Coagulation factor XIII (FXIII) is a heterotetramer consisting of two catalytic A subunits (FXIII-A2) and two protective/inhibitory B subunits (FXIII-B2). FXIII-B, a mosaic protein consisting of ten sushi domains, significantly prolongs the lifespan of catalytic subunits in the circulation and prevents their slow progressive activation in plasmatic conditions. Considering the importance of complex formation between the two FXIII subunits, it is surprising that the biochemistry of their interactions is only superficially explored. So far two values have been reported for the equilibrium dissociation constant (Kd) but calculations based on these values are contradictory to experimental data. Activated factor XIII (FXIIIa), a dimer of the Ca2+ activated truncated A-subunits (FXIII-A2*), is a transglutaminase that crosslinks primary amines to peptide-bound glutamine residues. Because in the few natural substrates of FXIII-A2* no consensus sequence could be identified around the reactive glutamine, studying the interaction between individual substrates and FXIII-A2* is of primary importance. Most of the α2 plasmin inhibitor (α2PI) molecules become truncated by a plasma protease, and the truncated isoform (N1-α2PI) is an important substrate of FXIII-A2*. The crosslinking of N1-α2PI to fibrin plays a major role in protecting newly formed fibrin from fibrinolysis. The N-terminal dodecapeptide N1-α2PI(1–12) of this molecule is an excellent glutamine donor peptide substrate of FXIIIa. In this study the biochemistry of the interaction between the two FXIII subunits and the interaction of FXIII-A2* with N1-α2PI(1–12) were investigated. Using surface plasmon resonance technique and an ELISA-type binding assay the Kd for the interaction of FXIII subunits was established in the range of 10-10 M. Based on the measured Kd, it was calculated that in plasma approximately 1% of FXIII-A2 should be in free form. This value was confirmed experimentally by measuring FXIII-A2 in plasma samples immuno-depleted of FXIII-A2B2 and free FXIII-B2. Free plasma FXIII-A2 became functionally active, when activated by thrombin and Ca2+, it cross-linked fibrin. In cerebrospinal fluid and tears with much lower FXIII subunit concentrations higher than 80% of FXIII-A2 existed in free form. Kinetic parameters for N1-α2PI(1–12) and for its truncated or synthetic mutants were determined by a spectrophotometric FXIIIa assay. The interaction of N1-α2PI(1–12) with FXIII-A2* was investigated by proton nuclear magnetic resonance (NMR) and saturating transfer difference (STD) NMR. Kinetic experiments with peptides in which the Asn1 residue was either truncated or replaced by alanine and proton NMR analysis of the FXIIIA2*– N1-α2PI(1–12) complex demonstrated that Asn1 is essential for effective enzyme–substrate interaction. Experiments with C-terminally truncated peptides proved that amino acids 7–12 are essential for the interaction of N1-α2PI(1–12) with the enzyme, and suggested the existence of a secondary binding site on FXIII-A2*. Hydrophobic residues, particularly Leu10, and the C-terminal Lys12 seemed to be especially important in this respect. The direct interaction between hydrophobic C-terminal amino acid side-chains and FXIII-A2* was demonstrated by STD NMR.