Molekuláris Orvostudomány Doktori Iskola

Állandó link (URI) ehhez a gyűjteményhez

https://hdl.handle.net/2437/2315

Általános Orvostudományi Kar

Molekuláris Orvostudomány Doktori Iskola
(vezető: Dr. Csernoch László)

Orvostudományi doktori tanács

D42

tudományág:
-elméleti orvostudományok

Doktori programok:

  • Jelátviteli folyamatok sejt- és molekuláris biológiája
    (programvezető: Dr. Virág László)
  • Membránbiofizikai kérdések és vizsgálómódszerek
    (programvezető: Dr. Szöllősi János)
  • Élettan és neurobiológia
    (programvezető: Dr. Csernoch László)

Böngészés

Molekuláris Orvostudomány Doktori Iskola Tárgyszó szerinti böngészés "2-D SDS PAGE"

Megjelenítve 1 - 1 (Összesen 1)
  • Nincs kép
    TételSzabadon hozzáférhető
    A fehérje mono-ADP-riboziláció fiziológiai szerepének vizsgálata Streptomyces coelicolor-ban
    Szentesiné Szirák, Krisztina; Penyige, András; Szirák, Krisztina; Molekuláris orvostudomány doktori iskola; DE--OEC--Általános Orvostudományi Kar -- Humángenetikai Tanszék
    A fehérjék-mono-ADP-ribozilációja egy reverzibilis poszttranszlációs módosítás, amelyet a mono-ADP-riboziltranszferáz (ADPRT) enzimek katalizálnak. Kísérleteink során a bonyolult morfológiai és differenciálódási folyamattal rendelkező és antibiotikumot termelő Streptomyces coelicolor A3(2) baktérium törzsben található ADP-ribozilált fehérjéket kívántuk izolálni és azonosítani. Célunk volt továbbá az eddig nem ismert ADPRT enzimek génjeinek szekvencia homológiák alapján történő azonosítása és egy ADPRT génre nézve null mutáns S. coelicolor törzs előállítása. A mutáns fenotípusának elemzésével és az endogén úton ADP-ribozilált fehérjék megismerésével a fehérje mono-ADP-riboziláció S. coelicolor-ban betöltött biológiai funkcióját akartuk megismerni. Elsőként a vad típusú S. coelicolor tenyészetből készített nyers citoplazmakivonatban in vitro ADP-riboziláltuk a fehérjéket. Az optimális reakció körülmények azonosítását követően m-aminofenilboronsav affinitás kromatográfiás eljárással tisztítottuk és 2-D SDS-PAGE gélen választottuk szét az ADP-ribozilált fehérjéket. A gélben történő tripszines emésztésből származó fragmentek MALDI-TOF tömegspektrometriás analízisével azonosítottunk nyolc ADP-ribozilált fehérjét: SCO5477, SCO2198, SCO2008, SCO4771, SCO1968, SCO4824, SCO6108, SCO7629. Hat fehérjét mi azonosítottunk először ADP-ribozilált fehérjeként, kettő esetében pedig megerősítettünk korábbi irodalmi eredményeket. A S. coelicolor genom in silico vizsgálatával azonosítottunk egy feltételezhetően ADPRT-t kódoló gént, a SCO5461-et. A SCO5461 gént egy apramycin rezisztenciáért felelős kazettával helyettesítettük a genomban, az így létrejött null mutáns (S. coelicolor M145 ∆SCO5461::apr) különböző táptalajokon normális vagy megkésett differenciálódást mutatott vagy nem is sporulált. A genomiális gén plazmidon való bejuttatásával komplementáltuk a mutánst, ezáltal annak kondícionális pleiotróp fenotípusa visszaváltozott a vad törzsre jellemzőre. A vad törzs, a null mutáns és a S. coelicolor M145 ∆SCO5461::apr/pWH1 komplementált mutáns törzs ADP-ribozilált fehérje mintázatának összehasonlítása azt mutatta, hogy a mutáns törzs mintájából hiányzik egy 65 kDa méretű ADP-ribozilált fehérje. A komplementált törzs mintájában újra megtalálható volt ez a fehérje. Kimutattuk, hogy folyékony és szilárd tápközegben és különféle szilárd táptalajokon eltért a mutáns actinorhodin termelésének mennyisége és az antibiotikum szekréciójának mértéke. Mindezekből arra következtettünk, hogy a SCO5461 egy ADPRT enzim, amely S. coelicolor differenciálódására és az antibiotikum termelésére, szekréciójára hat. The protein ADP-ribosylation is a reversible posttranslational modification catalised by mono-ADP-ribosyltransferases (ADPRT). Our aim was to isolate, and identify ADP-ribosylated proteins in Streptomyces coelicolor A3(2), which is an antibiotic-producing bacterial strain with complex morphology, and differentiation. Also, we wanted to find new potential ADPRT enzyme coding genes in the genome of S. coelicolor using sequence homology search and to prepare an ADPRT null mutant S. coelicolor strain. We planned to study the biological function of protein ADP-ribosylation in S. coelicolor by analysing the phenotype of the null mutant strain. First, proteins in the crude cytoplasm extract of wild type S. coelicolor were in vitro ADP-ribosylated. After optimisation of the reaction conditions ADP-ribosylated proteins were purified by m-aminophenylboronate affinity chromatography from crude extract of 36 hours S. coelicolor M145 cells cultivated on SFM medium. Samples were loaded onto 2-D SDS-PA gel. The separated proteins were in gel digested with trypsin, and the pattern of digested fragments were analysed by MALDI-TOF. Eight ADP-ribosylated proteins were identified using this method: SCO5477, SCO2198, SCO2008, SCO4771, SCO1968, SCO4824, SCO6108, and SCO7629. Six of the proteins were newly identified as ADP-ribosylated proteins, in two cases we have confirmated previous results in literature. In silico analysis of the S. coelicolor genome revealed a hypothetic ADPRT coding gene, the SCO5461. This SCO5461 gene was replaced by an apramycin resistance cassette. The generated null mutant – S. coelicolor M145 ∆SCO5461::apr – strain had a pleiotropic, conditional phenotype. The mutation delayed or completely inhibited the morphological differentiation and antibiotic production and secretion of the strain, depending on culture condities. The mutant was complemented with the introduction of a wild type gene carrying plasmid. The comparison of the pattern of ADP-ribosylated proteins of the wild-type, the null mutant, and the S. coelicolor M145 ∆SCO5461::apr/pWH1 complemented null mutant strains revealed, that an ADP-ribosylated protein with a molecular weight of 65 kDa was missing from pattern of the mutant strain. This protein, however reappeared in the complemented strain. So, we concluded that the SCO5461 is an ADPRT enzyme which is involved in the regulation of differentiation, antibiotic production and secrecion of S. coelicolor.