Egészségtudományok Doktori Iskola

Állandó link (URI) ehhez a gyűjteményhez

https://hdl.handle.net/2437/2313

Általános Orvostudományi Kar

Egészségtudományok Doktori Iskola
(vezető: Dr. Harangi Mariann)

Orvostudományi doktori tanács

D46

Doktori programok:

Megelőző orvostan és népegészségtan
(programvezető: Dr. Ádány Róza)
Anyagcsere és endokrin betegségek megelőzése és kontrollja
(programvezető: Dr. Paragh György)

Böngészés

Megjelenítve 1 - 10 (Összesen 10)

Szabadon hozzáférhető
Biological roles and prognostic relevances of gene alterations in human malignant melanomas
Vízkeleti, Laura; Balázs, Margit; Vízkeleti, Laura; Egészségtudományok doktori iskola; DE--OEC--Népegészségügyi Kar -- Megelőző Orvostani Intézet, Biomarker Analízis Tanszék
Malignant melanoma, originated from melanocytes is considered one of the most aggressive skin cancers, being the most life-threatening neoplasm of skin melanoma is responsible for almost all skin cancer deaths. Several molecular pathways and the complexity of their interaction are involved in disease development and progression. This characteristic suggests that no individual genetic or molecular alteration is crucial in these processes per se. The main purpose of the doctoral thesis was to examine the genetic alterations and gene expression changes of candidate genes (CCND1, BRAF, NRAS) and loci (7q31) with a possible role in human melanoma progression, and to define the associations between these alterations and the clinical-pathological parameters of primary melanomas. Our results revealed a significant association between the copy number alterations of 7q31 and poor clinical outcome. mRNA expression analysis of CAV1 and TES genes located on 7q31 locus showed a decreased CAV1 mRNA level in thick lesions, and decreased TES mRNA level in samples formed multiple metastases, whereas elevated TES mRNA expression was exhibited by primary melanomas formed only cutaneous or lymph node metastases. CAV1 protein level was significantly higher in thin primary tumors. TES protein expression did not show significant associations with any of the examined clinical-pathological parameters. Amplification of 7q31 is not or weakly correlated with the mRNA and protein expressions of CAV1 and TES genes. Regarding the results of CCND1 analysis, copy number alterations of the gene showed significant correlations with poor clinical outcome, which was influenced by the mutation status of BRAF or NRAS genes in the term of sun exposure. CCND1 mRNA level decreased in lesions with multiple metastases and was correlated with both the mRNA levels and mutation state of BRAF and NRAS genes. CCND1 protein expression was associated with Breslow thickness, metastasis formation, and shorter survival time. In conclusion, amplification of 7q31 and CCND1 could have a prognostic relevance in cutaneous melanoma predicting unfavorable outcome. Furthermore, our data show that expression alterations of the CAV1, TES and CCND1 genes possibly affect many aspects of tumor behavior. A melanocita eredetű malignus melanomát a legagresszívabb bőr daganatok között tartják számon. A bőr daganatok okozta halálozások döntő többsége az áttétes melanomáknak tulajdonítható. Az eltérő útvonalak érintettsége és az ezek közötti interakciók komplexitása azt sugallja, hogy az egyedi genetikai és molekuláris eltérések önmagukban nem rendelkeznek döntő befolyással a betegség kialakulásában és progressziójában. A disszertációban összefoglalt vizsgálatok célja volt olyan gének (CCND1, BRAF, NRAS) illetve lokuszok (7q31) genetikai és gén expressziós eltéréseinek vizsgálata, melyek szerepet játszhatnak humán melanomák progressziójában. Célunk volt továbbá a fent említett eltérések és a primer daganatok klinikai-patológiai jellemzői közötti összefüggések átfogó analízise is. Eredményeink alapján a 7q31 kópiaszám eltéréseinek primer melanomákban és áttétekben végzett FISH analízise szignifikáns összefüggést mutatott ki a kedvezőtlen klinikai kimenetellel. A lokuszon elhelyezkedő CAV1 és TES gének mRNS expressziós analízise csökkent CAV1 kifejeződést tárt fel vastag melanomákban, és a TES mRNS szint csökkenését a többszörös áttétképző primer mintákban; míg azok a léziók, melyek csupán kután vagy nyirokcsomó metasztázissal rendelkeztek, emelkedett TES mRNS szinttel jellemezhetők. A CAV1 fehérje szint szignifikánsan magasabb vékony primer tumorokban, míg a TES fehérje expresszió nem mutatott összefüggést egyetlen vizsgált paraméterrel sem. A 7q31 amplifikáció nem vagy csak gyenge korrelációban állt a CAV1 és TES gének mRNS és fehérje expressziós változásaival. A CCND1 vizsgálatok eredményeit tekintve, a gén kópiaszám eltérések szignifikáns összefüggést tárt fel a primer melanomák kedvezőtlen klinikai kimenetelével. Ezt az összefüggést befolyásolta a BRAF és NRAS gének mutációs státusza a napsugárzásnak való kitettség esetében. CCND1 mRNS szint csökkenés figyelhető meg azokban a primer tumorokban, melyek többszörös áttétképzéssel jellemezhetők; és a gén expresszió korrelációt mutat mind a BRAF és NRAS mRNS szintekkel, mind pedig ez utóbbi gének mutációs státuszával. A CCND1 protein fokozott expressziója pedig az áttétképzéssel és rövidebb túléléssel társul, valamint a fehérje szint összefüggést mutat a Breslow tumor vastagsággal is. Eredményeinket összefoglalva, a 7q31-es lokusz és CCND1 gén amplifikációja prognosztikai jelentőséggel bírhat kután melanomák kedvezőtlen klinikai kimenetelével kapcsolatban. Továbbá, az eredmények azt mutatják, hogy a CAV1, TES és CCND1 gének expressziós eltérései is számos szempontból befolyásolhatják a tumor biológiai viselkedését.
Szabadon hozzáférhető
Characterization of distinct molecular genetic alterations in BRAF and NRAS mutated human primary melanoma
Lázár, Viktória; Balázs, Margit; Egészségtudományok doktori iskola; DE--OEC--Népegészségügyi Kar -- Egészségtudományok Doktori Iskola; DE--ATC--Mezőgazdaság- Élelmiszertudományi és Környezetgazdálkodási Kar --
Summary Human malignant melanoma is one of the most aggressive forms of skin cancer with an exceptionally bad prognosis. Melanoma often display constitutively activated MAPK pathway through BRAF or NRAS mutations. It is also known that these mutations are almost never simultaneously present and that they appear at early stages and preserved throughout tumor progression, although it is proved that these alterations alone are insufficient to cause tumor progression. Therefore the first aim of our study was to evaluate those distinct genetic alterations which can properly differentiate the three important molecular subtypes of primary melanomas with a) BRAF, b) NRAS mutation andc) WT (wild type for both loci). Mutation analysis in the BRAF and NRAS oncogene was performed by melting curve analysis using fluorescent probes. High-resolution array comparative genomic hybridization (array CGH) was used to assess genome-wide analysis of DNA copy number alterations. Based on our array CGH data primary melanomas with BRAF mutation exhibited more frequent losses on 10q23-q26 and gains on chromosome 7 and 1q23-q25 compared to melanomas with NRAS mutation. Loss on the 11q23-q25 sequence was found mainly in conjunction with NRAS mutation. Hierarchical cluster analysis revealed that the presence of BRAF mutation is associated with deletion pattern on 10q chromosome and is frequently observed in lesions with advanced clinical stages. Based on these results we proved the existence of marked differences in the genetic pattern of the BRAF and NRAS mutated melanoma subgroups that might suggest that these mutations contribute to malignant melanoma in conjunction with distinct cooperating oncogenic events. In general, it is an interesting phenomenon suggesting that these mutations provide probably the ‘guiding force’ for these tumors and it also suggests that there are alternative genetic pathways to melanoma. These additional oncogenic events which are associated with BRAF or NRAS mutations can provide rational additional targets for a combination therapy with kinase inhibitors. In this study we also investigated the specific dynamic activities among different signaling pathways highlighted the frequent alterations of genes involved in the signaling interactions between the MAPK-JAK pathways in BRAF mutated melanomas. Using Random Forest analysis we also found a gene alteration signature in the MAPK pathway that was commonly related to the presence of the BRAF mutation in our melanoma cohorts. The second aim of this study was to develop an accurate Q-PCR method for determining the co-amplification pattern of six candidate genes that reside in the 11q13 amplicon core. We found that coamplification of these candidate genes or the CCND1 amplification along with either BRAF or NRAS mutations might be more important for prognosis than the presence of these alterations alone. Összefoglalás A malignus melanoma az egyik legagresszívabb bőrdaganat, melyek jelentős része rendkívül rossz prognózissal jellemezhető. A melanomák többségében a MAP-kináz útvonal konstitutívan aktiválódik, melyet az NRAS vagy BRAF onkogének mutációja okoz a melanomák tumorigenezisének korai fázisában. Ezen mutációkról már leírták, hogy a daganat progresszió során végig fennmaradnak. A mutációk jelenlétének és prognosztikai jelentőségének eddigi vizsgálatai viszont kimutatták, hogy ezeknek a mutációknak egyedüli jelenléte viszont még nem elegendő a daganatok kialakulásához. Vizsgálataink során kiemelt figyelmet szenteltünk a BRAF és NRAS mutációt hordozó primer melanomák jellegzetes molekuláris eltéréseinek megismerése. A teljes genom eltéréseinek analízisére array-CGH-et alkalmaztunk. A mutációk jelenlétét floureszcensen jelölt oligonukleotid próbák segítségével, olvadáspont analízissel vizsgáltuk. A BRAF-mutációt hordozó daganatokban a leggyakoribb eltérések az 1-es kromoszóma hosszú karjának, illetve a teljes 7-es kromoszómának a DNS-többlete és a 10-es kromoszóma hosszú karjának DNS-hiánya voltak. Az NRAS-mutációt hordozó daganatokra a 11q22.3-11q25 régióban gyakran előforduló deléció volt jellemező. Hierarchikus klaszter analízisünk szerint a 10-es kromoszóma hosszú karjának deléciója szignifikánsan gyakrabban fordul elő BRAF mutációt hordozó és előrehaladott stádiumban lévő primer daganatokban. Eredményeink alapján feltételezhetjük, hogy annak ellenére, hogy az NRAS és a BRAF onkogének aktivációs mutációi ugyanazon szignáltranszdukciós útvonalat aktiválják, a primer melanomák tumorigenezise során eltérő genetikai alterációkkal kooperálnak. Ez a melanoma progresszió során tapasztalt jelenség rendkívül figyelemre méltó, hiszen arra utalhat, hogy a BRAF és NRAS mutációk egyfajta vezérlő erőként funkcionálnak az alternatív genetikai útvonalakat feltételező melanomagenezis során. Eredményeink elemzése során a különböző szignál transzdukciós útvonalak részletesebb vizsgálatával felderítettük, hogy a BRAF mutációt hordozó daganatokban leggyakrabban a MAPK-JAK szignalizációs útvonalak közötti interakcióban résztvevő fehérjék génjei sérülnek majd Random Forest analízis segítségével azonosítottunk további BRAF mutációval összefüggésbe hozható gyakori gén kópiaszám eltéréseket a MAPK útvonalból. Valamint részletesen tanulmányoztuk a 11q13 amplifikációs régió géneltéréseit, melyet korábbi CGH vizsgálataink során a melanoma egyik leggyakoribb genetikai eltéréseként azonosítottunk. Eredményeink arra utalnak, hogy a 11q13 régióban lokalizálódó onkogének ko-amplifikációja, a BRAF vagy NRAS mutáció együttes előfordulása a CCND1 emelkedett géndózisával társulva gyakrabban jellemző rossz prognózisú daganatokra, mint ezen genetikai eltérések jelenléte külön-külön.
Szabadon hozzáférhető
Eltérő biológiai viselkedésű humán melanomák genetikai jellemzése in situ hibridizációs módszerekkel
Treszl, Andrea; Balázs, Margit; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Népegészségügyi Iskola -- Megelőző Orvostani Intézet; Egészségtudományok doktori iskola
1. Interfázisos FISH analízissel kimutattuk, hogy primer melanomák és melanoma metasztázisok genetikailag heterogén sejtpopulációkat tartalmaznak. 2. A biológiai viselkedés szempontjából elkülönülő noduláris és felszínen terjedő melanomák között az alábbi kromoszóma eltéréseket figyeltük meg: •A 7-es kromoszóma kivételével, a felszínen terjedő melanomákban jelentős számban fordult elő monoszómiás sejtpopuláció. •Az 1-es, 3-as, 6-os, 7-es és 8-as kromoszómák poliszómiája a noduláris altípusban gyakoribb volt. •A 6-os kromoszóma poliszómiáját szignifikánsan több noduláris melanomában mutattuk ki. •A 9-es kromoszóma vesztést a szuperficiális altípusban, a 10-es kromoszóma egyik centromérájának delécióját a noduláris altípusban figyeltük meg gyakrabban. 3. Megállapítottuk, hogy a CGH-el korábban felismert 8q22-qter DNS többlet összefügg a c-myc onkogén kópiaszámának növekedésével. Jelentős mértékű c-myc amplifikáció csak a rosszabb prognózisú noduláris melanomákban volt kimutatható. 4. A c-myc gén amplifikációja és a klinikopatológiai paraméterek között az alábbi összefüggéseket találtuk: •A törzsön, illetve a fej-nyaki régión elhelyezkedő daganatok közül szignifikánsan több noduláris melanománál mutattunk ki c-myc amplifikációt, mint a végtagokon elhelyezkedő lézióknál. •A noduláris melanomák között az extra c-myc kópiát tartalmazó kifekélyesedett tumorok száma szignifikánsan nagyobb volt, mint a felszínen terjedő daganatoknál. •A nyirokcsomó metasztázist képző noduláris melanomák között szignifikánsan több daganat mutatott c-myc gén kópiaszám emelkedést. •Azoknál a betegeknél, akik a primer tumor eltávolítását követően 5 éven belül meghaltak, a c-myc gén kópiaszám emelkedés gyakoribb volt a noduláris melanomákban (p = 0,02). 5. A felszínen terjedő melanomából származtatott új sejtvonal genetikai elemzése során megállapítottuk: •A sejtvonal és az eredeti tumor eltéréseinek többsége a CGH profilok alapján megegyezett, ami arra utal, hogy a sejtvonal genetikai elváltozásai domináltak az eredeti tumorban is. •Az M35/01 sejtvonal kariotípusa komplex, a kromoszómák számbeli eltérései mellett számos strukturális eltérés is jelen volt. •A sejtvonal analízise centroméra- és gén-specifikus szondákkal felveti az aneuploidia szerepének fokozott fontosságát a daganatprogresszió során a génamplifikációval/delécióval szemben. •Az új melanoma sejtvonal genetikai elemzése bizonyítja, hogy a különböző szintű genetikai eltérések felismerése több módszer párhuzamos alkalmazását igényli. 6. A BAC és cDNS array alapú komparatív genom hibridizációs módszerekkel a kromoszómális CGH-hez képest pontosabban meghatározható az amplifikált és deletált szekvenciák lokalizációja. •Az array-CGH alapján a sejtvonalban a legnagyobb mértékű amplifikációt a 7q (7q22-q31), 15q (15q21-q25), 20q (20q13) kromoszómakarokon, a legnagyobb mértékű deléciót a 4q (4q12, 4q28-q31, 4q32-q33), 9p (9p21, 9p23, 9p24), 9q (9q21), 10q (10q23-q25), 12q (24.3), 16q (16q13-q21, 16q21, 16q23) 18p (18p11, 18q21-23), 17p (17p12) kromoszómaszakaszokon figyeltük meg. •A primer tumorok array-CGH eredményeinek összehasonlításakor 58 olyan ismert gént találtunk, melyek minden mintában deletálva (31 gén), illetve minden mintában amplifikálva (27 gén) voltak.
Szabadon hozzáférhető
Genetic and epigenetic alterations of invasive melanoma cells
Koroknai, Viktória; Balázs, Margit; Egészségtudományok doktori iskola; DE--Általános Orvostudományi Kar -- Népegészségügyi Kutató Intézet
A tumorsejtek inváziója a metasztázis képzés első lépése, melynek során a sejtek képesek a környező szövetek infiltrációjára. Tekintettel arra, hogy a sejtek invazív képességéhez különböző molekuláris eltérések járulhatnak hozzá, célul tűntük ki a daganat progresszióban meghatározó szerepet játszó invazív melanoma sejtek genetikai és epigenetikai eltéréseinek vizsgálatát melanoma sejtvonal modell rendszerekben. A sejtek invazív képességének meghatározásához Matrigel inváziós kamrát használtunk. Az invazív sejtek genetikai eltéréseinek elemzéséhez array komparatív genom hibridizációt alkalmaztunk (CGH). A sejtek metilációs mintázatának elemzéséhez Illumina Infinium array-t használtunk, a génexpressziós változásokat Affymetrix Human Gene 1.0 ST array-vel határoztuk meg. A primer tumor eredetű invazív sejtvonalak szignifikáns eltérései a 7q deléció és a 12q amplifikációja voltak. Továbbá, az invazív sejtvonalakban szignifikánsan magasabb volt a GDNF (5p13.1), GPAA1, PLEC és SHARPIN (8q24.3) gének kópiaszáma a nem invazív sejtvonalakhoz hasonlítva. Ezeknek a géneknek az eltérései a metasztázis eredetű sejtvonalakban is jelen voltak, ami a metasztázis képzésben betöltött lehetséges szerepükre utal. Továbbá megfigyeltük, hogy az invazív sejteket főként hipermetilált mintázat jellemzi. A DNS metiláció eredményeit és a génexpressziós profilt integrálva kimutattuk, hogy a hipermetilált gének egy csoportjára csökkent génexpresszió jellemzi. Számos olyan metilációs eltérést is azonosítottunk, melyek szerepet játszhatnak a melanoma progressziójában, beleértve az ARHGAP22 és NAV2 gének promóter hipermetilációját, melyek eltérést mutattak az invazív tulajdonsággal jellemzett primer melanoma és a metasztázis mintákban is. A dolgozat részletes elemzést ad az invazív melanoma sejtek genetikai és epigenetikai eltéréseiről, továbbá eredményeink hozzájárulhatnak a melanoma sejtek agresszív viselkedésének megértéséhez.
Szabadon hozzáférhető
Genetic and epigenetic background of melanoma progression
Ecsedi, Szilvia; Balázs, Margit; Egészségtudományok doktori iskola; DE--Népegészségügyi Kar --
The main purpose of the doctoral thesis was to provide a comprehensive genetic and epigenetic study to define somatic DNA alterations that contribute to the aggressive biological behavior of human primary melanomas. Investigating genome-wide (transposable) DNA methylation: - We demonstrated the strong influence of LINE 1 transposable demethylation in the metastatic formation of primary melanomas during the follow-up period. Studying regional (localized) DNA methylation: - The methylome, presenting in early stage samples and associated with the BRAFV600E mutation, decreased in the more advanced stages of the disease. - Local coordinated allele loss and DNA hypermethylation was shown at the region of 6q22-q23 that encodes the MYB1 and EYA4 genes. - We revealed that the 19p13.2 genomic region harboring DNMT1 gene (DNA methylatransferase-1 responsible for the maintenance of methylation patterns during DNA replication) often suffers from DNA copy number loss in melanomas thicker than 4 mm. - The DNA methylation changes of the KIT gene was significantly associated with shortened relapse-free survival in melanoma patients. Integrative genomic analysis: - A set of genes with copy number loss were defined in ulcerated malignant melanomas, which were significantly enriched on chromosome 6q and 10q. Most of the genes were involved in cell-cell and cell-matrix adhesion or apoptosis. - The first evidence for trans-acting copy number changes was given in melanomas. - The expression and methylation patterns of additional genes exhibited an inverse correlation, suggesting that transcriptional silencing of these genes is driven by epigenetic events. In conclusion, we demonstrated the strong influence of genome-wide as well as regional DNA methylation changes on melanoma progression. Methylation pattern was demonstrated to be a part of an integrated apparatus of somatic DNA alterations. We identified functionally relevant molecular hotspots characterised by copy number losses and promoter hypermethylation that might indicate a poor clinical outcome of melanoma.A doktori disszertáció egyik fő célja volt, hogy átfogó képet kapjunk a primer malignus melanoma agresszív biológiai viselkedésével összefüggő genetikai és epigenetikai változásokról. Genom szintű (transzpozonális) DNS metilációs analízis: - Eredményeink szerint a LINE 1 transzpozon szekvencia hipometilációja kapcsolatba hozható a primer melanomák áttétképző képességével. Regionális (lokalizált) DNS metilációs vizsgálatok: - A BRAFV600E mutációt hordozó mintákat, továbbá a korai stádiumú melanomákat egyedi hipermetilációs mintázat jellemzi, mely csökken a daganat progressziója során. - Lokális, összehangolt génkópiaszám csökkenést és DNS hipermetilációt figyeltünk meg a MYB1 és EYA4 géneket kódoló 6q22-q23 kromoszóma szakaszon. - A DNMT1 gént (fenntartó metiltranszferáz, mely a kialakult metilációs mintázat örökítéséért felel a DNS replikáció során) kódoló szakasz gyakran szenved deléciót a 4 mm-nél vastagabb daganatokban. - Megállapítottuk, hogy a KIT gén hipermetilációja a melanomás betegek csökkent 5 éves túlélésével társul. Integrált genom analízis: - A kifekélyesedő felszínű melanomákban számos kópiaszám csökkenést detektáltunk a 6q és 10q kromoszóma szakaszokon. A gének többsége a sejt-sejt, sejt-mátrix és az apoptózisban résztvevő fehérjéket kódolnak. - Elsőként mutattunk ki a melanoma genomban transz-irányba ható kópiaszám-változásokat. - Megfigyeltük a génexpresszió és DNS metiláció inverz korrelációját, mely jelenség az epigenetikai mechanizmusok transzkripciós szabályozását erősítik melanoma progresszió során. Eddigi eredményeink alapján mind a genom szintű, mind a regionális metilációs változások hozzájárulnak a melanoma progressziójához. Kimutattuk, hogy a DNS metilációs változások a kópiaszám-eltérésekkel együttműködve járulnak hozzá a daganat megváltozott fenotípusához. Integrált genom analízis segítségével ún. genomi forrópontokat azonosítottunk, valamint a kópiaszám-változások hatását távolabbi génekre is kimutattuk.
Szabadon hozzáférhető
Humán malignus melanoma progressziójával társuló genetikai eltérések analízise in situ hibridizációs módszerekkel
Ádám, Zsuzsanna; Balázs, Margit; DE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Népegészségügyi Iskola -- Megelőző Orvostani Intézet; Egészségtudományok doktori iskola
A betegekből származó melanoma szövetmintákon és sejtvonalakon végzett kísérleteink során alkalmazott CGH és FISH érzékeny és hatékony módszernek bizonyult a melanoma kromoszómális eltéréseinek kimutatásában. Primer melanomán és metasztázisán interfázisos FISH módszerrel bizonyítottuk, hogy a kromoszómális deléciók nemcsak a tumor progresszióban, de a tumor iniciációjában is szerepet játszanak. Megállapítottuk, hogy a genetikai aberrációk fokozatos akkumulációja együtt jár a melanoma agresszivitásának növekedésével. CGH adataink alapján a genetikailag heterogén primer tumor számos sejtpopulációja között a klonális szelekció eredményeként megjelenik a metasztatikus sejtklón. A 7-es kromoszóma többlete a malignus melanomában rossz prognózissal társul, eredményeink szerint aneuploidiája vagy a kromoszómán lokalizálódó gének amplifikációja kapcsolatban állhat a fokozott metasztázisképző potenciállal. Az agresszív, máj-metasztázist képző sejtvonalban a metasztázisképző hajlamhoz társuló genetikai eltérések közül eddig ismeretlen 4-es kromoszóma deléciója újabb fontos, az áttétképzéssel összefüggésbe hozható onko-szuppresszor gének jelenlétére hívhatja fel a figyelmet. Megállapítottuk, hogy a 9-es és 10-es kromoszóma vagy ezeknek a kromoszómáknak bizonyos szakaszai a metasztatikus progresszió korai fázisában deletálódnak és ezek a genetikai eltérések a távoli metasztázisok kialakulásában is szerepet játszanak. A 6p és a 8q szakaszok amplifikációja későbbi eltérések és elsősorban a tumor növekedésében és az invázióban játszanak szerepet, a 7-es kromoszóma aberráció a metasztázis megjelenéséhez, a 4-es kromoszóma elvesztése pedig a távoli máj-metasztázis kialakulásához köthető. Ezeknek a kromoszómáknak az aberrációi így egy progressziós sort képviselnek. Saját és az irodalomban megjelent tanulmányok alapján a 7-es kromoszóma többlet és a 9p és 10q kromoszóma karok vesztése a metasztázis kialakulásához kapcsolódó genetikai markereknek tekinthetők.
Korlátozottan hozzáférhető
Melanoma progresszióval összefüggő genetikai és génexpressziós változások
Rákosy, Zsuzsa; Balázs, Margit; Egészségtudományok doktori iskola; DE--OEC--Népegészségügyi Kar -- Megelőző Orvostani Intézet
A dolgozatban szereplő vizsgálatok fő célja a humán melanoma progressziójában szerepet játszó genetikai és génexpressziós eltérések tanulmányozása, az eltérések klinikopatológiai paraméterekkel történő korrelációs analízise volt. 1. Primer melanomák klinikopatológiai paramétereivel összefüggő génexpressziós eltéréseket vizsgálva, szignifikáns mértékű expressziós változást mutattunk ki a daganatok felszínének kifekélyesedésével (ulceráció) és a melanomák metasztatázisképző tulajdonságával. • Ulcerációval öszefügő mRNS szint változást 1095 génnél figyeltünk meg, gének többsége az ulcerált felszínű melanomákban csökkent expresszióval társult. Ugyanezen gének megnövekedett expressziós szintjét detektáltuk a nem kifekélyesedő felszínű melanoma mintákban. • A rossz prognózisú melanomákban a legmagasabb expressziós átlagértéket az osteopontin génre mutattunk ki. A jobb prognózisú daganatokban legnagyobb mértékben a defenzin  szintje emelkedett meg, mind az OPN mind a defenzin az Nf-B transzkripciós faktor indukcióját okozza. • Az ulcerált felszínű melanomákban csökkent expressziójú gének funkcióját vizsgálva kimutattuk, hogy többségük a bőr- és szőrfejlődési funkció, dermatológiai betegségek, daganatfejlődés, sejtosztódás a sejtciklus, sejt-sejt interakció és sejtmotilitás szabályozó folyamatokhoz tartozik, a p53, ERK/MAP, IP3/AKT és WNT/ katenin, Nf-B molekulási útvonalakon hatva. • Array CGH és génexpressziós adatainkat összehasonlítva, a génexpressziós szint csökkenés hátterében a vizsgált géneknél megállapítottok, hogy nem az adott kromoszómális szakasz deléciója áll. 2. Hiearchikus klaszter analízissel kimutattuk, hogy a nyirokcsomó metasztázisok génexpressziós mintázata rossz prognózissal jellemezhető primer melanomák génexpressziós profiljához hasonló. 3. Saját adatainkat összehasonlítva irodalmi génexpressziós eredményekkel, 212 melanoma progresszióval összefüggő génexpressziós változást mutató közös gént azonosítottunk. 4. Interfázisos FISH analízissel kimutattuk, hogy az EGFR génkópiaszám többlete, primer melanomákban rossz prognózissal társul. • Deléció és kismértékű amplifikáció szignifikánsan nagyobb mértékben fordult elő férfi betegekből származó melanomákban. • Az EGFR gén kópiaszáma szignifikánsan magasabb a 4,01 mm-nél vastagabb Breslow vastagságú daganatokban. • A követési időn belül metasztázist képző léziókra a gén kis- és nagymértékű amplifikációja egyaránt jellemző elváltozás. A tumorsejtekben kimutatott EGFR extra kópia a betegek rövidebb túlélésével társul. • Hasonlóan szignifikáns asszociációt mutattunk ki a daganatok felszíni kifekélyesedése valamint az EGFR gén többlet között. 5. A gén amplifikációs státusza és az EGFR mRNS valamint a fehérje expresszió mértéke között nem volt lineáris korreláció. • A léziókban az EGFR fehérje kismértékű expresszióját vagy annak teljes hiányát figyeltük meg függetlenül a minták EGFR gén kópiaszámától és az mRNS expresszió szintjétől. 6. A 19-es exon aktivációs mutációt, ami más daganatok jellegzetes alterációja, egyetlen melanoma mintában sem detektáltuk. 7. FISH vizsgálataink során kimutattuk, hogy a 9p21 vesztés gyakori eltérés sporadikus primer melanomákban. • A 9p21-es lokusz delécióját mind a korai, mind a késői melanomákban megfigyeltük. • A 9p21 deléciója mellett a lokusz kópiaszám többletét is kimutattuk. • Nem találtunk szoros korrelációt a 9p21-es lokusz genetikai eltérései és a daganatok klinikopatológiai tulajdonságai között. ----- Our main purpose was to investigate the genetic and gene expression changes during the melanoma progression, and to correlate the alteration to the clinicopathological parameters of tumors. 1. Correlation of gene expression changes of primary melanomas and clinicopathological variables of lesions, significant association was only present related to the ulceration and metastases formation of tumors. • The Volcano plot analysis identified 1095 significantly differentially expressed genes are associated with ulceration. Major part of differentially expressed genes (1021) was found to be down regulated in ulcerated melanomas versus less aggressive group, whereas these genes were upregulated in melanomas without ulcerated surface • Osteopontin (OPN) was the most highly expressed genes in aggressive melanomas. The defensin-, was the most highly up-regulated genes in less aggressive melanomas. Both genes activate the Nf-B transcription factor. • This gene signature is comprised of critical mediators of hair and skin development and function, organ development, dermatological diseases and conditions cellular development, cellular growth and proliferation, cardiovascular system development and function cell morphology, cellular assembly and organization, cell-to-cell signaling and interaction. We also demonstrated that these genes are mainly involved in the p53, ERK/MAP, Nf-kB, WNT/ -catenin pathways. • Comparing the results of aCGH and microarray, there was no correlation between decreased gene expression and genome alterations in the melanomas 2. Gene expression pattern of lymphnode metastases was found to be more similar to that of the more-aggressive melanomas than the less-aggressive melanomas. 3. We found that elevated copy number of EGFR gene is associated with poor prognosis in primary melanomas. amplified • Deletion and low level amplification was significantly higher in tumors removed from male patients compared to female patients. • The average number of EGFR gene copies was significantly higher in tumors that were thicker than 4.00 mm compared to the thinner tumors. • The EGFR gene copy number index in tumors that formed metastasis within 5 years after the diagnosis of the primary lesion was significantly higher. Outcome of patients whose primary tumors had highly amplified or extra copies of the EGFR gene was poor. • Significant correlation was also detected between the ulceration of the tumor surface and the elevated EGFR gene copies. 4. The correlation between the gene amplification status and the level of mRNA and protein expression was not linear. • Samples exhibited weak or lack of EGFR protein expression without strong correlation between EGFR gene copy number alterations and the level of EGFR protein expression. 5. No mutation was seen in any of the analyzed samples within tyrosine kinase domain in exon 19 of the EGFR gene. 6. Our FISH results demonstrate that, the loss of 9p21 is a frequent alteration in primary melanomas. • 9p21 deletion is present in early and late stages of the disease at similar frequency. • Beside on chromosome 9 and 9p21 losses we also detected copy number gain of CEP 9 and 9p21. • Comparing the 9p21 status of melanomas and the patients’ clinical parameters we could not find strong correlation.
Szabadon hozzáférhető
Molecular alterations associated with a BRAF inhibitor and an ER stress inducer
Szász, István; Balázs, Margit; Egészségtudományok doktori iskola; DE--Általános Orvostudományi Kar -- Népegészség- és Járványtani Intézet
Vizsgálataink célja melanomák BRAF inhibitorral (BRAFi, PLX4720: vemurafenib analóg) szemben létrejött rezisztencia hátterében álló molekuláris mechanizmusok részletes felderítése volt. Kísérleteink során BRAF inhibitor rezisztens primer és metasztázis eredetű melanoma sejvonalakat hoztunk létre és vizsgáltuk a sejtvonalak közötti molekuláris eltéréseket. ArrayCGH elemzéseink során új, a rezisztenciával összefüggésbe hozható kópiaszám eltéréseket találtunk az EXT1, SAMD12 és a REXO1L2P géneknél. Irodalmi adatok alapján az EXT1 gén ígéretes új célpont lehet egyes daganatok antraciklin terápiával szemben kialakuló rezisztencia leküzdésében. Megfigyeltük, hogy rezisztencia kialakulását követően egy sejtvonalnál BRAF-inhibitor “függőség” jött létre, ami teljes összhangban van mások megfigyelésével. Ezek szerint egyes BRAF- vagy MEK-inhibitorral szemben rezisztens melanomás betegek képesek ismét érzékennyé válni a gyógyszeres kezelésre, ami ígéretes terápiás lehetőséget jelenthet a kiválasztott betegek számára. Proteome Profiler Oncology Array vizsgálataink során megfigyeltük, hogy 84 daganat specifikus fehérje közül hat fehérje (ANGPLT4, EGFR, Endoglin, FGF2, Serpin E1, és VCAM-1) az összes rezisztens sejtvonalban növekedett expresszióval jellemezhető, ugyanakkor az OPN és a Survivin fehérjék expressziója csökken. Ezeknek a fehérjéknek a megváltozott expressziója egyértelműen arra utal, hogy a rezisztencia kialakulása több jelátviteli útvonalat érint, melyek megismerése további vizsgálatokat sürget a sikeres, több targetet célzó terápiák kidolgozásához. Párhuzamosan a BRAF inhibitorral szemben kialakult rezisztencia molekuláris hátterének feltárása mellett, vizsgáltuk egy nemrégiben szintetizált gyógyszer (HA15) hatását BRAFV600E mutáns melanoma sejteken. Az eredeti közlemény szerint a HA15 ER stresszt indukálva olyan hatásokat vált ki, melyek autofágián és apoptózison keresztül, jelentősen csökkentik a melanoma sejtek életképességét, ami független a melanoma sejtek mutációs státuszától és a rezisztencia kialakulásától. A publikált adatokkal ellentétben az in vivo állapotot közelítő sejttenyésztési körülmények között nem mutattunk ki szignifikáns melanoma sejtpusztulást HA15 kezelés során, csak azok a sejtek voltak érzékenyek a HA15-re, melyek előzőleg tápanyag megvonásban részesültek. Stressz és autofágia markerek kvantitatív analízise szerint a HA15 önmagában nem vált ki ER stresszt, de azt szinergikusan fokozza a tápanyag megvonással kezelt sejtekben. Ellentétben a közölt adatokkal HA15 rezisztens melanoma sejtvonalak is létrehozhatók. Összefoglalva, további vizsgálatokra van szükség annak bizonyítására, hogy a HA15 hatékony a melanoma ellenes gyógyszernek tekinthető.
Szabadon hozzáférhető
Molecular background of acquired resistance of BRAFV600E mutated human melanoma
Patel, Vikas; Balázs, Margit; Egészségtudományok doktori iskola
Despite intensive research efforts, which have significantly improved melanoma patient survival, therapy resistance to the targeted mono- and combined therapies remains unsolved problems. The major focus of our study was to investigate molecular alterations associated with acquired resistance in malignant melanoma cell line models. It has been observed that the gene expression pattern of cells is altered during conventional cell culturing due to the unlimited access to oxygen, metabolites, nutrients, and signalling molecules. One aims of our study was to generate reproducible three-dimensional melanoma spheroid models from BRAF inhibitor sensitive and resistant melanoma cell lines and compare the gene expression signatures of the differently cultured melanoma cells. Using Affymetrix Human Gene arrays, we determined the gene expression pattern of melanoma cell lines. We found a large number of differentially expressed genes between drug-sensitive cells grown under different cell cultures. Pathway analysis showed that the differently expressed genes were mainly associated with cell cycle, p53, and other cancer-related pathways. Drug-resistant cells grown under 2D and 3D cell culture conditions exhibited 297 differentially expressed genes (72 up- and 225 downregulated) and were linked to various pathways including cellular translation, axon guidance, and IGF1R signalling. In addition, 13 genes, including DCUN1D1, CMSS1, ZNF639, ABHD4, and HIST1H2BB, exhibited inverse expression between sensitive- and resistant spheroid, with functional role in anoikis resistance and cell cycle regulation. In parallel, we explored molecular alterations associated with acquired resistance during combinatorial treatment of BRAFV600E mutant melanoma cell lines using BRAF and MEK inhibitors. After establishing six melanoma cell lines that became resistant during encorafenib (BRAFi) and binimetinib (MEKi) treatment we evaluated the invasive properties, studied the effect of “drug holiday” on cell proliferation and protein expression in the drug-sensitive and resistant cell lines, investigated the gene expression characteristics underlying BRAFi/MEKi resistance using RNAseq analyses and defined the biological functions of the differently expressed genes associated with the development of acquired resistance. We found that resistant cells changed their phenotype and had a higher invasive potential than sensitive cells. We observed that resistant cells did not develop drug dependency, which is in agreement with a recently published clinical study that suggests intermittent dosing might not be as beneficial as regular treatment. Using the Proteome Profiler Oncology Array, we identified cancer-related proteins that were differently expressed across sensitive and resistant cell lines, with no similar pattern among the cell lines. Furthermore, transcriptome analysis revealed that the 1591 differentially expressed genes (1024 up- and 567 down-regulated genes) are functionally linked to a variety of biological functions, including epithelial-mesenchymal transition, and KRAS signalling, that may lead to resistance. In summary, our data provide the first insight into differently expressed genes that might be involved in spheroid formation in BRAFi sensitive and resistant melanoma cells. The current data on the development of acquired resistance using combination of BRAF and MEK inhibitors, offer the first understanding into differentially expressed genes and provide protein expression patterns associated with a BRAFi/MEKi-resistant phenotype in melanoma cells. Our findings contribute to a better understanding of the complex mechanisms leading to acquired resistance during combined treatment of BRAF-mutant melanoma. However, further studies are needed to identify the key molecules and signalling pathways responsible for therapeutic escape during BRAFi/MEKi treatment and to prevent the initiation of acquired drug resistance in melanoma.
Szabadon hozzáférhető
The role of osteopontin expression during malignant melanoma progression.
Kiss, Tímea; Balázs, Margit; Egészségtudományok Doktori Iskola
Az oszteopontin (OPN) egy olyan multifunkcionális glükofoszfoprotein, mely számos daganat progressziójában fontos szerepet játszik. Elősegítheti a daganatos sejtek migrációját, döntő szerepet játszik a sejtadhézióban és szoros összefüggést mutat a metasztázisok jelenlétével. Korábbi génexpressziós vizsgálataink szerint a rosszabb prognózisú melanomákban a legmagasabb expressziós szintet az OPN gén mutatta. Ezért célul tűztük ki az OPN daganat progresszióban betöltött szerepének tanulmányozását eltérő viselkedésű melanomák és különböző eredetű melanoma sejtvonalak segítségével. Vizsgáltuk az OPN molekulához kapcsolódó egyik fő szignalizációs útvonalban részt vevő NF-κβ p65 fehérje kifejeződését eltérő biológiai viselkedésű humán melanoma sejtvonalakon immunfluoreszcens jelölés segítségével. A génexpressziós adataink jó korrelációt mutattak munkacsoportunk előzetes mRNS expressziós értékeivel. A fehérje kifejeződését a vizsgált primer melanomák 90%-ában kimutattuk. Klinikai adatokkal történt korrelációs analízisünk szerint a fokozódó OPN-expressziós szintek kedvezőtlenül befolyásolják a betegség kimenetelét. In vitro kísérleteinkben NF-κβ p65 fehérje sejtmagi lokalizációját figyeltük meg egy magas OPN szintet mutató sejtvonalban. Az OPN gén csendesítése során az mRNS szint csökkenését tapasztaltuk. Továbbá megfigyeltük, hogy a transzfektált sejtvonal invazív képessége csökkent az eredeti sejtvonalhoz képest. A fehérje expressziós vizsgálataink során a tanulmányozott fehérjék többségénél csökkent expressziót figyeltünk meg az OPN csendesített sejtvonalakban. Megállapíthatjuk, hogy az OPN emelkedett szintje jelentősen hozzájárul a daganatsejtek progressziójához, a metasztázisképzéshez, ezért melanomákban is fontos biomarkernek tekinthető. A géncsendesítést követően az OPN mRNS szint mellett a fehérje expressziója, valamint a sejtek invazív képessége is csökkent, ezért feltételezhetjük, hogy az OPN fontos lehet a melanoma terápia optimalizálásában.

Böngészés

Egészségtudományok Doktori Iskola Szerző szerinti böngészés "Balázs, Margit"

Találat egy oldalon

Rendezési lehetőségek